乙酰乳酸脱羧酶体外重组表达与酶学性质分析

摘要

乙偶姻及其氧化还原产物双乙酰、2，3-丁二醇均是重要的四碳平台化合物，在食品、制药、燃料和航天等领域具有非常重要的用途。在细菌发酵生产这三种四碳平台化合物途径中，乙酰乳酸脱羧酶(Acetolactate decarboxylase，ALDC)是控制α-乙酰乳酸代谢流的关键酶，它能催化外消旋的α-乙酰乳酸分子发生脱羧反应，生成单一手性产物(R)-乙偶姻。多数微生物体具有生产ALDC的能力，但是不同来源的ALDC在结构与酶学性质方面有很大差异。Enterobacter aerogenes和Enterobacter cloacae是常见的具有2，3-丁二醇生产能力的菌株;然而一株来源于近海污泥高产乙偶姻(41.63 g/L)的菌株Bacillussubtilis DL01，在发酵过程中检测不到副产物双乙酰和2，3-丁二醇的产生。因此，本论文以上述三株细菌为出发菌株，通过基因克隆和重组表达的三种ALDC，研究ALDC结构与酶活性关系。
　　论文研究将不同来源ALDC的编码基因克隆、重组到Ecoli BL21中。经IPTG在37℃诱导后重组基因获得可溶性表达。通过离子交换层析和凝胶层析两个步骤成功获得了电泳纯的ALDC，SDS-PAGE结果显示三种ALDC分子量大小均为30 kDa左右。生物信息学分析表明，ALDC-B.s与另外两者的氨基酸序列相似度仅有40％;分子对接结果表明三种ALDC更倾向于直接催化(S)型底物反应，其中ALDC-E.c与底物的结合能最小，而ALDC-B.s的最大，说明ALDC-E.c较ALDC-B.s表现出更好的底物亲和性。根据ALDC催化反应所发生的特殊手性变化，采用圆二色光谱技术测定三种ALDC的活性，结果表明，ALDC-B.s的比活力为1853.26 U/mg，约是ALDC-E.c的1.8倍和ALDC-E.a的2.2倍。相同pH条件下三者活性有所差异，且部分二价金属离子能对ALDC产生激活作用。酶反应动力学常数显示ALDC-B.s的Km值为20.94 mM;而ALDC-E.c与ALDC-E.a的Km值接近，分别为12.20与14.83 mM，与ALDC-B.s相比，ALDC-E.c与ALDC-E.a表现出更好的底物亲和性;ALDC-B.s的kcat值为2.21 s-1，大于ALDC-E.c的kcat0.96 s-1与ALDC-E.a的kcat0.81 s-1，表现出更高的催化效率;这与生物信息学的预测结果相符。

目录

声明

摘要

引言

1 文献综述

1．1 ALDC概述

1．2 ALDC的活性调节

1．3 ALDC的结构研究

1．4 ALDC的催化机制研究

1．5 ALDC基因的重组表达与理化性质研究

1．5．1 ALDC基因克隆与表达

1．5．2 ALDC的理化性质

1．6 ALDC的应用

1．6．1 啤酒发酵工业

1．6．2 合成单一手性化合物

1．7 本论文的选题依据与研究内容

2 ALDC基因重组表达与纯化

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 实验仪器

2．2．2 主要实验材料

2．2．3 主要溶液配制

2．3 实验方法

2．3．1 ALDC基因的克隆

2．3．2 重组大肠杆菌的构建

2．3．3 重组基因pET-21b-ALDC的表达

2．3．4 IPTG诱导条件的优化

2．3．5 ALDC分离纯化

2．3．6 重组表达ALDC含量的测定

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 ALDC基因克隆

2．4．2 构建大肠杆菌重组菌体

2．4．3 SDS-PAGE检测重组基因pET-21b-ALDC表达

2．4．4 IPTG诱导时间与使用浓度

2．4．5 ALDC分离纯化

2．4．6 ALDC纯化倍数及回收率

2．5 小结

3 ALDC生物信息学分析

3．1 引言

3．2 生物信息学软件及网络服务器

3．3 分析方法

3．3．1 ALDC氨基酸序列比对与系统发育树构建

3．3．2 ALDC三维结构模拟

3．3．3 ALDC与底物分子对接

3．4 分析结果与讨论

3．4．1 氨基酸序列相似性比对

3．4．2 构建系统发育树

3．4．3 ALDC的同源模建

3．4．4 分子对接

3．5 小结

4 ALDC酶学性质分析

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 实验仪器

4．2．2 主要试剂

4．2．3 主要溶液配制

4．3 实验方法

4．3．1 外消旋α-乙酰乳酸为底物测定ALDC酶活性

4．3．2 pH对ALDC活性影响的测定

4．3．3 金属离子对ALDC活性影响的测定

4．3．4 酶反应动力学常数的测定

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 ALDC的酶活性

4．4．2 ALDC的最适pH

4．4．3 金属离子对ALDC活性的影响

4．4．4 Km及Kcat测定结果分析

4．5 小结

结论与展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢