过表达锌响应基因对酿酒酵母胁迫耐性的影响

摘要

石油资源不可再生，且其运输和使用过程中可能对环境造成污染，因此，作为可再生能源之一的燃料乙醇的生产，尤其是利用廉价木质纤维素资源生产燃料乙醇受到普遍关注。酿酒酵母是广泛用于燃料乙醇生产的微生物菌种，但其在木质纤维素乙醇生产过程中会受到多种环境胁迫条件的影响，包括高浓度乙酸、高温、以及终产物乙醇的毒性等，这些环境胁迫条件导致细胞活性和发酵效率降低。因此，选育耐性良好的工业酿酒酵母菌株对提高燃料乙醇的生产效率具有重要的意义。
　　本课题组前期研究发现，硫酸锌添加可提高絮凝酵母对环境胁迫的耐受性。转录组以及蛋白组学分析发现，一些锌响应基因的转录和蛋白表达在硫酸锌添加组细胞中比对照水平上调，但锌提高酿酒酵母环境胁迫耐性的机理还不清楚。本论文从相关组学研究结果中选取了不同代谢途径相关的四个基因，包括精氨酸水解酶基因CAR1（其编码产物水解精氨酸为鸟氨酸）;一氧化氮(NO)代谢相关的黄素血红蛋白编码基因YHB1;液泡蛋白酶B基因PRB1和调控铁离子吸收的铜离子转运相关金属伴侣蛋白基因ATX1，研究其过表达对酿酒酵母环境胁迫耐性的影响，并获得锌提高酿酒酵母环境胁迫耐性机理的认识。
　　以工业酿酒酵母Sc4126作为宿主酵母菌株，获得了以上四个基因过表达的重组酿酒酵母菌株。耐受性比较结果表明，与含有空载体的对照菌株相比，过表达目的基因的重组菌株(4126-ATX1、4126-YHB1、4126-PRB1、4126-CAR1)对乙酸、高温、过氧化氢、乙醇等胁迫条件的耐受性显著提高;胁迫条件下的乙醇发酵结果表明，在5 g/L乙酸胁迫条件下，与对照菌株相比，四株重组菌株均可以缩短发酵时间达6h以上，乙醇发酵效率提高;在41℃高温条件下，四株重组菌株均可以正常进行发酵，而对照菌株则无法将葡萄糖完全耗完。乙酸胁迫条件下，4126-CAR1菌株对数期的胞内鸟氨酸含量显著高于对照菌株，而且和无胁迫对照条件比较，胁迫条件下CAR1过表达菌株更多氨基酸含量下调，提示氨基酸代谢在乙酸胁迫条件下在重组菌株中发生重构;4126-ATX1菌株胞内铁含量显著高于对照菌株，提示ATX1基因编码的金属伴侣蛋白可以增强细胞乙酸胁迫条件下对铁的吸收。本文的研究结果表明，YHB1、PRB1、ATX1、和CAR1过表达可作为提高酿酒酵母环境胁迫耐性的有效策略，这些研究结果为进一步深入酿酒酵母功能基因组的研究，揭示这些基因对酿酒酵母环境胁迫耐性影响的分子机制，以及选育优良的酿酒酵母菌株，提高酿酒酵母利用纤维素水解液进行乙醇发酵的效率提供了参考。