基于石墨烯/纳米金类过氧化氢酶的miRNA比色传感研究

摘要

微小核糖核酸(microRNA，简称miRNA)是一类非编码小分子RNA，它能够调节生物体的生长、分化和发育等生命活动，并且miRNA在癌症和其他疾病中具有特异性表达的特点，是评价污染物基因毒性的潜在生物指标，因此实现miRNA的定量检测有重要的意义。目前，miRNA的检测方法主要有Northern blotting法、实时荧光定量PCR法、微阵列芯片法等，但是这些方法准确度差、耗时长、操作繁琐、灵敏度低及重现性差。因此，急需建立操作简单，特异性好，灵敏度高的miRNA检测方法。
　　本文基于石墨烯/纳米金复合物类过氧化氢酶的性质及肽核酸(Pentose Nucleic Acid，PNA)对该复合材料催化性能的调节作用，提出了一个简单的、非标记的比色传感方法，实现了miRNA的定量检测。由于π-π共轭作用，PNA探针可以吸附到石墨烯/纳米金复合物的表面，使复合物的催化活性受到抑制，导致过氧化氢酶底物分子TMB的氧化程度降低，体系的颜色变化不明显。而在不同浓度的目标miRNA存在下，PNA探针首先与目标miRNA杂交形成双链结构（PNA/miRNA），由于双链结构与石墨烯/纳米金复合物的作用力较弱，会离开复合物的表面，石墨烯/纳米金的类过氧化氢酶的活性逐渐恢复，体系颜色发生明显变化，通过反应前后颜色的变化，可以对体系中的目标miRNA进行定量分析。
　　在最优条件下，该比色传感方法对miRNA-21的检测范围为10nM-0.98μM，检测限为3.2 nM，比已报道的非标记的miRNA比色传感方法的检测限更低，显示了较高的灵敏性;其标准偏差为3.7％(n=3)，显示了良好的重现性;相同条件下，该传感方法对干扰miRNA（miRNA-125b、miRNA-29a）几乎没有响应，显示了良好的特异性识别能力。此外，该比色传感方法可以用于人体血清中miRNA的检测以及miRNA混合体系中目标物的检测。因此，该比色传感方法为miRNA的检测提供了一种新的思路，并有望应用于生物样品中目标miRNA的定量检测。

目录

声明

摘要

引言

1 绪论

1．1 miRNA的检测方法

1．1．1 miRNA定义及作用

1．1．2 miRNA生物检测技术

1．1．3 miRNA传感检测技术

1．2 生物传感器

1．2．1 生物传感器的组成和原理

1．2．2 生物传感器的分类及特点

1．2．3 生物传感器的应用

1．3 基于石墨烯及复合物的生物传感器

1．3．1 石墨烯结构及其性质

1．3．2 石墨烯复合物的合成

1．3．3 基于石墨烯及复合物的传感方法

1．4 研究背景、思路、内容和意义

1．4．1 研究背景

1．4．2 研究思路

1．4．3 研究内容

1．4．4 研究意义

2 实验材料与仪器

2．1 实验材料

2．2 实验仪器

2．3 实验方法与步骤

2．3．1 石墨烯氧化物的合成

2．3．2 石墨烯／纳米金的合成及优化

2．3．3 氧化石墨烯及石墨烯屋内米金的表征

2．3．4 荧光探针与石墨烯／纳米金复合物作用

2．3．5 检测条件的优化

2．3．6 比色传感方法的灵敏度评价

2．3．7 比色传感方法的特异性评价

2．3．8 比色传感方法在实际样品中的应用

3 结果与讨论

3．1 设计原理

3．2 石墨烯／纳米金制备及制备条件的优化

3．2．1 HAuCl4浓度的优化

3．2．2 水热体系时间的优化

3．2．3 水热体系pH值的优化

3．2．4 水热体系温度的优化

3．3 石墨烯偿内米金的表征

3．3．1 透射电镜(TEM)表征

3．3．2 紫外-可见光谱表征

3．3．3 Raman光谱表征

3．4 荧光探针与石墨烯／纳米金复合物之间的作用机制

3．5 检测探针的确定

3．6 检测条件优化

3．6．1 催化剂浓度的优化

3．6．2 催化温度及pH值的优化

3．6．3 H2O2浓度的优化

3．6．4 H2O2底物浓度的优化

3．6．5 缓冲溶液类型的优化

3．6．6 适配子长度的优化

3．6．7 ssPNA吸附时间及浓度的优化

3．7 比色传感器方法的灵敏度评价

3．8 比色传感方法的特异性评价

3．9 比色传感方法在实际样品中的应用

3．9．1 血清中miRNA-21的检测

3．9．2 miRNA混合体系中miRNA-21的检测

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢