两种β-1,3-葡聚糖酶的性质表征与功能分析

摘要

β-1,3-葡聚糖酶是一类能够水解以β-1,3-糖苷键连接的葡聚糖的酶系，广泛分布于真菌、植物、细菌和无脊椎动物中。β-1,3-葡聚糖酶是重要的细胞壁水解酶,可以降解真菌的细胞壁,在真菌病害防治中发挥重要作用，因此成为抗真菌基因工程的研究热点之一。昆虫和细菌β-1,3-葡聚糖酶属于GH16家族，目前对其功能和抗真菌活性的相关研究还不充分。因此，本论文以亚洲玉米螟β-1,3-葡聚糖酶和环状芽孢杆菌β-1,3-葡聚糖酶为对象，分析其酶学性质和生物活性，期望为靶向真菌细胞壁的生物防治策略提供新的酶源。本论文包括以下研究工作：
　　（1）获得了亚洲玉米螟β-1,3-葡聚糖酶的cDNA序列OfLam，该cDNA的CDS长度为1128 bp，可编码氨基酸长度为375 AA，理论分子量为42.2 kD，等电点pI=5.16。进化分析表明，OfLam与昆虫源β-1,3-葡聚糖酶的亲缘关系最近，具有GH16家族特征性的保守催化基序；实时荧光定量PCR实验表明，亚洲玉米螟β-1,3-葡聚糖酶在其中肠中表达水平远高于其他组织，且在幼虫时期的表达量远高于卵期、蛹期和成虫期。
　　（2）构建了pET28a-OfLam表达载体，获得了亚洲玉米螟β-1,3-葡聚糖酶OfLam，采用金属螯合层析，在250 mM咪唑溶液中获得目的蛋白，产量为2.5 mg/L。SDS-PAGE结果显示，重组OfLam的实际分子量约为30 kD，比理论值小，具有β-1,3-葡聚糖酶活性；生化性质表征的结果显示，亚洲玉米螟β-1,3-葡聚糖酶OfLam对底物昆布多糖的最适pH为4.5，最适反应温度为50℃；其Km值为1.59±0.28 mg/mL，kcat值为15.8±0.66 s-1；重组OfLam具有广泛的底物谱，并可以水解真菌细胞壁。
　　（3）实现了环状芽孢杆菌β-1,3-葡聚糖酶BcLam的重组表达，采用金属螯合层析，在250 mM咪唑溶液中获得目的蛋白，产量为50 mg/L。据SDS-PAGE和质谱鉴定，重组 BcLam的实际分子量为43.29 kD；生化性质表征的结果显示，环状芽孢杆菌β-1,3-葡聚糖酶BcLam对底物昆布多糖的最适pH为6.0，最适反应温度为50℃，与其他来源的β-1,3-葡聚糖酶相比，BcLam具有宽泛的底物谱和最高的水解活性。在真菌细胞壁降解实验中，结合预处理手段，BcLam表现出优于商品化酶的高活性，且BcLam与烟曲霉几丁质酶B按摩尔浓度1:1，水解效率增加。在抑制尖孢镰孢菌孢子生长的实验中，BcLam与AfChiB也具有协同效应，其中BcLam发挥主要作用。
　　（4）对BcLam的结晶条件进行了初筛，在2个目标蛋白浓度共400个筛选条件中确定3个初步结晶条件，将进行下一步优化。

目录

声明

引言

1 文献综述

1.1 β-1,3-葡聚糖

1.2 β-1,3-葡聚糖酶

1.3 β-1,3-葡聚糖酶的应用

1.4 本论文的选题依据和研究内容

2 亚洲玉米螟β-1,3-葡聚糖酶基因OfLam的调取及序列分析

2.1 引言

2.2 实验材料与方法

2.3 实验结果与讨论

2.4 小结

3 亚洲玉米螟OfLam的重组表达、分离纯化与表征

3.1 引言

3.2 实验材料与方法

3.3 实验结果与讨论

3.4 小结

4. 环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）β-1,3-葡聚糖酶BcLam的重组表达、分离纯化及性质表征

4.1 引言

4.2 实验材料与方法

4.3 实验结果与讨论

4.4 小结

结论

展望

参考文献

附录A OfLam的cDNA序列及编码氨基酸序列

附录B 亚洲玉米螟β-1,3-葡聚糖酶基因OfLam与欧洲玉米螟β-1,3-葡聚糖酶基因OnLam的序列比对

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢