剪切力和ATP时空信号刺激血管内皮细胞钙动力学响应的微流控研究

摘要

在体的血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)暴露在血流环境中，受到血液中可溶性生化因子三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)以及血流产生的壁面剪切力的刺激作用，这些能引起细胞响应的生化因子浓度和壁面剪切力大小往往随时间变化而以动态形式呈现。VECs可识别这些动态信号并将其转导至细胞内部，引起细胞内钙离子(Ca2+)浓度的动力学响应，而Ca2+动力学响应则与迁移、增殖、生长、分化、凋亡等细胞行为和功能均密切相关。由于体内VECs微环境中的干扰因素太多，不易实现动态剪切力和/或ATP信号诱发Ca2+动力学响应的直接研究，在体外建立研究壁面剪切力和ATP信号诱发Ca2+动力学响应的研究方法显得尤为重要。而传统方法如细胞培养皿和矩形平行平板流动腔(parallel-plate flow chamber，PPFC)等不易为细胞加载壁面剪切力和ATP时空信号刺激。微流控作为一种用于模拟微环境研究的新技术，以其精确控制微环境中生物力学和/或生化刺激因子浓度的优点，近年来得到了广泛应用。然而，以往关于VECs内Ca2+动力学的微流控研究大多侧重于随时间恒定的生化因子刺激或剪切力刺激的影响。本论文结合理论分析，实验观测和数值仿真，利用微流控技术构建出可加载动态壁面剪切力和ATP协同刺激信号的研究方法，并对不同刺激条件下VECs内Ca2+动力学响应进行了研究。
　　本研究包含以下几部分内容:
　　第一、基于驻点流原理和物质对流-扩散方程设计了可产生剪切力和ATP时空信号的新型微流控芯片及其外围动态信号加载系统。通过流体力学分析，获得了微流控通道内剪切力和ATP的时空分布，并进一步验证了该新型微流控芯片系统能为培养在同一微流控通道底部的内皮细胞提供单独剪切力信号、单独ATP信号、以及剪切力和ATP信号的组合刺激。
　　第二、根据上述设计搭建了实际的微流控芯片及其外围装置系统。结合数值仿真和荧光素溶液实验分析了微流控芯片通道中生化信号在定常流和脉动流中的传输特性，验证了微流控芯片通道是一个低通滤波器，并考察了生化信号的频率、流量率和传输距离等因素对滤波效应的影响;进一步研究了脉动流对生化信号的非线性幅频调制现象，及其与生化信号频率、脉动流信号频率和信号传输距离等因素的相关性。
　　第三、通过充分考量引起滤波效应和非线性幅频调制的因素以及细胞本身对刺激的敏感性，设计并验证了不产生滤波和非线性调制现象的生化信号时空分布。利用外围动态信号加载系统为培养在微流控芯片底部的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)提供剪切力和ATP时空信号刺激，并实时观察和分析细胞内Ca2+动力学响应，获得了不同剪切力和/或ATP信号组合刺激下HUVECs内Ca2+信号动态响应，发现剪切力和ATP信号的协同作用，而不是单独的剪切力或ATP信号，在HUVECs信号转导中扮演着重要角色。尤其是在不同频率的剪切力信号和ATP信号组合刺激下，细胞内Ca2+信号的幅度和频率与剪切力、ATP刺激信号强度和频率紧密相关。
　　综上所述，本研究设计和构建了可为贴壁VECs提供剪切力信号和ATP信号单独或联合时空刺激的微流控芯片装置，研究了剪切力和ATP信号协同刺激下细胞Ca2+动力学响应。本论文提出的微流控芯片装置还可用于研究其他贴壁细胞对剪切力和/或生化因子时空信号协同刺激下的生物响应及其潜在的分子机制。

目录

声明

摘要

图目录

表目录

主要符号表

1 绪论

1．1 研究背景与意义

1．1．1 细胞外微环境的复杂性和动态性

1．1．2 细胞内Ca2+信号动力学的重要功能

1．2 国内外相关工作研究进展

1．2．1 体外模拟动态生化信号的微流控研究

1．2．2 体外模拟剪切力刺激的微流控研究

1．3 本文研究思路、内容及技术路线

1．4 本文组织结构

2 微流控芯片及动态信号加载装置的流体力学设计

2．1 Y型微流控通道设计及流体力学分析

2．2 具有驻点流特点的变截面微流控通道设计及流体力学分析

2．3 Y型均匀截面微通道与驻点流变截面微通道的整合及其流体力学分析

2．4 微流控通道的计算分析方法

2．4．1 2D计算方法

2．4．2 3D计算方法

2．5 微流控通道内流场分布

2．5．1 流线与流场分布

2．5．2 流速剖面

2．5．3 3D流速仿真结果和2D解析公式的比较

2．6 微流控通道内壁面剪切力分布

2．7 恒定生化因子在微流控通道定常流中的的空间浓度分布

2．8 动态生化信号的生成原理及实验系统的整体设计

2．9 讨论

2．10 本章小结

3 生化信号在微通道内传输时的传输特性：低通滤波效应和非线性幅频调制

3．1 引言

3．2 微流控芯片装置系统的搭建

3．2．1 微流控芯片装置系统的构成

3．2．2 实验设备和材料

3．2．3 微流控芯片加工制作

3．2．4 动态荧光素信号的产生方法

3．3 研究方法

3．3．1 数值模拟方法

3．3．2 荧光素溶液实验验证方法

3．4 生化信号在定常流中的传输特性：低通滤波效应

3．4．1 数值仿真结果

3．4．2 荧光素溶液实验验证结果

3．5 生化信号在脉动流中的传输特性：非线性幅频调制

3．5．1 数值仿真结果

3．5．2 荧光素溶液实验验证结果

3．6 讨论

3．7 本章小结

4 剪切力和ATP时空信号对细胞内钙信号动力学的影响

4．1 引言

4．2 设备和材料

4．2．1 实验设备

4．2．2 实验材料

4．3 方法

4．3．2 荧光素溶液实验验证方法

4．3．3 试剂配制

4．3．4 细胞培养

4．3．5 细胞内Ca2+信号响应胞外刺激实验

4．4 实验结果与分析

4．4．1 动／静态ATP信号在微流控通道内不同位置处的时空分布

4．4．2 微流控通道内不同位置处提供单独或者联合剪切力和生化信号的刺激

4．4．3 单独或联合动态剪切力和静态ATP信号刺激对细胞内Ca2+响应的影响

4．4．4 单独或联合静态剪切力和动态ATP信号刺激对细胞内Ca2+响应的影响

4．4．5 单独静／动态ATP信号刺激对细胞内Ca2+响应的影响

4．4．6 不同频率动态剪切力和动态ATP信号刺激对细胞内Ca2+响应的影响

4．5 讨论

4．6 小结

5 结论与展望

5．1 结论

5．2 创新点

参考文献

攻读博士学位期间科研成果及科研项目

致谢

作者简介