特异性内毒素去除吸附剂的制备和应用

摘要

脓毒血症是由于内毒素入血造成的一类威胁生命的重大疾病，目前在血液中去除内毒素的方法大多是基于静电作用和疏水作用，但是这种非特异性吸附方法也会吸附血液中的蛋白质，因而无法应用于临床。另外，在革兰氏阴性菌制备疫苗等蛋白类生物制品时，会伴随菌体破裂带来内毒素污染，也面临内毒素去除特异性的问题。因此，急需一种特异性强的、亲和力高的内毒素结合材料。甘露糖结合凝集素（Mannose-binding lectin,MBL）和脂多糖结合蛋白（Lipopolysaccharide-binding protein,LBP）是人体内天然存在的对内毒素具有特异结合能力的蛋白质，因此本论文以该两种蛋白为研究对象，通过基因工程，制备重组蛋白，并将其用于内毒素的检测与去除。具体研究内容为： （1）MBL和LBP的制备：通过基因工程，构建了融合抗体Fc结构域和MBL的质粒pOptiVECTM-TOPO?-FcMBL，并将其转化入人胚肾细胞，FcMBL表达量110mg/mL。通过蛋白A亲和层析得到纯度95%以上的FcMBL。LBP基因分别构建到毕赤酵母和大肠杆菌表达载体，未能实现酵母中的高效表达，但在大肠杆菌中，LBP可溶表达量约30-50mg/L，通过金属离子螯合层析得到纯度90%以上的LBP。酶联免疫法（ELISA）检测表明制备的两种蛋白都具有结合内毒素的能力，且FcMBL结合能力更高。用生物膜层干涉技术（BLI）测得FcMBL与内毒素的平衡解离常数为3.839×10-7M。 （2）内毒素检测方法的建立：优化并比较分析了FcMBL的夹心酶联免疫（ELISA）和其它2种常用内毒素检测方法。结果表明，基于FcMBL的夹心ELISA法适于10-250μg/ml的内毒素浓度检测；在优化过的反应条件下，显色基质鲎试剂法适于0-0.5EU/mL（约0-0.1ng/mL）内毒素浓度检测；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）银染法适合于0.03-2mg/mL的内毒素检测。 （3）FcMBL吸附剂制备及效果研究：将FcMBL固载于蛋白A磁性琼脂糖微球和双环氧活化的琼脂糖凝胶CL-6B制备成吸附剂。通过吸附动力学测定、等温吸附实验、吸附特异性实验等方法，在内毒素浓度1mg/mL时，FcMBL磁性微球吸附剂吸附容量0.4mg/mL，FcMBL琼脂糖凝胶吸附剂和已有的阳性对照多粘菌素B吸附剂吸附容量均达到3.5mg/mL左右，但FcMBL吸附剂的吸附特异性明显高于多粘菌素B。

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