微生物菌群发酵粗甘油生产1，3-丙二醇的研究

摘要

1，3-丙二醇(1，3-propanediol，1，3-PD)是一种重要的化工原料，应用广泛，主要作为单体合成聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)和聚呋喃二甲酸丙二酯(PTF)。目前1，3-PD的生产方法包括化学法和生物法，生物法具有利用可再生资源、条件温和、环境污染小等优点，越来越受到人们的重视。生物法生产1，3-PD主要是以微生物纯培养技术为基础，需要严格的无菌条件、使用的原料具有一定的纯度，同时在发酵过程中常伴随乙酸、乳酸、乙醇、2，3-丁二醇(BD)等副产物的生成，给下游产物的分离纯化带来困难并增加了1，3-PD的生产成本。为了克服纯培养技术的缺点，本论文以微生物菌群为研究对象，考察了微生物菌群转化粗甘油生产1，3-PD的发酵特性、微生物菌群中单菌间的相互作用、微生物菌群的稳定性以及微生物菌群的结构组成对菌群功能的影响。主要研究结果如下:
　　(1)从大连海域筛选了两个微生物菌群DL38和CJD-3，并通过间歇发酵实验对两个微生物菌群的发酵性能进行比较。实验结果表明:微生物菌群DL38生产1，3-PD的浓度和转化率要高于微生物菌群CJD-3，并且产生的副产物较少，两者的副产物中均不含BD，利于产物1，3-PD的分离纯化降低生产成本。在间歇发酵实验中微生物菌群DL38最高可耐受200 g/L甘油，1，3-PD的浓度可达到81.40 g/L，转化率为0.63 mol/mol。通过微生物菌群结构分析表明两个微生物菌群发酵性能的差异与两个菌群的结构组成有关，主产1，3-PD的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)在微生物菌群DL38中所占的比例(95.57％)显著高于在微生物菌群CJD-3中所占的比例(85.99％)。从微生物菌群DL38中分离纯化了三株克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae):单菌W3、Y1和Y5。当甘油浓度为40 g/L时，单菌W3主产1，3-PD(17.84 g/L)，是微生物菌群DL38的优势菌株;单菌Y5主产1，3-PD(9.63 g/L)和乙醇(7.60 g/L)，而单菌Y1主产乙醇(12.69 g/L)。当三种单菌按照比例W3∶ Y5∶ Y1=208∶82∶17进行混合发酵时发酵性能最佳，并且优于其他单菌混合比例和单菌W3单独发酵，表明在自然状态下微生物菌群的组成具有一定的优越性和合理性，并且单菌之间的协同作用可以提高混合菌群的底物耐受性和1，3-PD的产量。
　　(2)通过间歇发酵实验和微生物菌群结构分析，考察了影响微生物菌群稳定性及发酵性能的关键因素。实验结果表明:随着传代培养次数的增加，微生物菌群DL38的发酵性能发生了改变(该此菌群命名为DL38-BH)，如发酵时间延长，1，3-PD的产量和转化率下降，并且副产物中乳酸、乙醇的产量增加。通过16S rRNA高通量测序发现，微生物菌群DL38的结构组成发生了显著变化，如微生物菌群中主产1，3-PD的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）在菌群中的比例从95.57％降低到71.46％，而不产1，3-PD的肠球菌科(Enterococcaceae)和莫拉氏菌科(Moraxellaceae)的比例大幅度增加，分别从2.10％和1.21％增加到15.31％和12.97％。通过间歇发酵实验发现，微生物菌群DL38-BH中主产1，3-PD的单菌W3-BH发酵甘油的时间延长，并且1，3-PD的产量下降，副产物中乳酸和乙醇的含量大幅度增加;单菌Y5-BH消耗甘油的速度加快，1，3-PD的产量降低，乳酸和乙醇的产量均增加;单菌Y1-BH消耗甘油的速度也加快，1，3-PD、乳酸、乙酸的产量增加，但乙醇的产量有所下降。由此推断正是由于微生物菌群结构组成和菌群中单菌发酵性能的变化，导致了原始微生物菌群DL38发酵性能的改变。
　　(3)通过间歇发酵实验和微生物菌群结构分析，考察了离子液体对微生物菌群转化粗甘油生产1，3-PD的影响。实验结果表明:离子液体对微生物菌群发酵性能的影响不仅与离子液体的种类有关，还与离子液体和底物的浓度有关。当粗甘油的浓度为60 g/L、[Emim][TfO]为10 g/L时，微生物菌群DL38-BH生产1，3-PD的浓度和转化率显著提高，分别由23.14 g/L、0.45 mol/mol增加到31.17 g/L、0.60 mol/mol。与对照组相比，添加离子液体[Emim][TfO]后的微生物菌群DL38-BH中主产1，3-PD的克雷伯氏菌属(Klebsiella)的数量和比例显著增加，分别由51346个、79.20％增加到55514个、89.50％，而菌群中不产1，3-PD菌属的含量显著下降。菌群DL38-BH中Klebsiella含量的增加提高了与甘油代谢相关的三种关键酶(GDH、GDHt和PDOR)的活性，从而使产物1，3-PD的产量和转化率有所提高。在利用单菌进行间歇发酵中，离子液体影响单菌生产副产物的种类和产量，但是对1，3-PD的产量和转化率并没有显著的影响。由此得出结论，离子液体通过调整微生物菌群的结构组成来影响菌群的发酵性能。
　　(4)通过添加抗生素和微生物菌群中优势种的方式，考察微生物菌群结构的改变对菌群发酵性能的影响。实验结果表明:氨苄青霉素虽然提高了微生物菌群DL38-BH中克雷伯氏菌属所占的比例（由85.86％增加到94.98％），使甘油消耗速度加快，但是1，3-PD的产量并没有增加，可能是由于菌群中主产乙醇的单菌Y5-BH和Y1-BH比例增加的缘故。通过增加微生物菌群中单菌W3-BH和Y5-BH的比例对菌群结构进行调整，提高了微生物菌群DL38-BH的发酵性能，发酵时间由30h缩短到26h，1，3-PD的产量和转化率有所增加，分别由21.31 g/L、0.25 mol/mol提高到37.16 g/L、0.35 mol/mol。
　　综上所述，微生物菌群发酵技术可以代替纯培养发酵技术来解决廉价原料难以利用、底物转化率低、副产物多、发酵和分离成本高等产业化难题，为微生物菌群用于其他生物基化学品的生产制备提供参考。

目录

声明

摘要

图目录

表目录

主要符号表

1 绪论

1．1生物基化学品的概况

1．1．1生物基平台化合物

1．1．2生物炼制

1．2 1，3-丙二醇的研究进展

1．2．1生产1，3-丙二醇的菌种

1．2．2生物法生产1，3-丙二醇的原料

1．2．3甘油生物转化1，3-丙二醇的代谢途径

1．2．4生物法生产1，3-丙二醇的工艺类型

1．2．5生物法生产1，3-丙二醇的分离提取工艺

1．3微生物组的研究进展

1．3．1微生物与微生物组

1．3．2工业微生物组的应用

1．3．3微生物组的研究方法

1．3．4人工微生物菌群的研究

1．3．5微生物组中细胞间的相互作用

1．4微生物菌群结构与代谢调控方式

1．4．1 离子液体在生物炼制中的应用

1．4．2抗生素对微生物的作用机制

1．5本文主要研究思路

2微生物菌群的筛选及发酵性能研究

2．1 引言

2．2材料与方法

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．2．3 接种物

2．2．4培养基配制

2．2．5实验方法

2．2．6分析方法

2．3结果与讨论

2．3．1微生物菌群的筛选

2．3．2微生物菌群的结构分析

2．3．3微生物菌群DL38的发酵性能实验

2．3．4微生物菌群CJD-3的发酵性能实验

2．3．5微生物菌群DL38中单菌的发酵性能实验

2．4本章小结

3微生物菌群的稳定性研究

3．1 引言

3．2材料与方法

3．2．1 实验试剂

3．2．2实验仪器

3．2．3接种物

3．2．4培养基配制

3．2．5实验方法

3．2．6分析方法

3．3结果与讨论

3．3．1微生物菌群发酵性能的变化

3．3．2微生物菌群结构的变化

3．3．3微生物菌群中单菌发酵性能的变化

3．3．4单菌W3-BH底物耐受性实验

3．3．5 单菌Y5-BH转化甘油生产1，3-PD和乙醇性能实验

3．3．6单菌W3-BH、Y5-BH和Y1-BH混合发酵实验

3．4本章小结

4离子液体对微生物菌群发酵粗甘油生产1，3-丙二醇的影响

4．1 引言

4．2材料与方法

4．2．1 实验试剂

4．2．2实验仪器

4．2．3接种物

4．2．4培养基和试剂的配制

4．2．5 实验方法

4．2．6分析方法

4．3结果与讨论

4．3．1 不同离子液体对微生物菌群间歇发酵的影响

4．3．2 不同浓度离子液体对微生物菌群间歇发酵的影响

4．3．3 不同底物浓度对含离子液体的微生物菌群间歇发酵的影响

4．3．4 [Emim][TfO]对微生物菌群胞内氧化还原状态的影响

4．3．5[Emim][TfO]对3-羟基丙醛浓度的影响

4．3．6[Emiml[TfO]对微生物菌群甘油代谢中关键酶活性的影响

4．3．7[Emim][TfO]对单菌转化粗甘油性能的影响

4．3．8[Emim][TfO]对微生物菌群结构组成的影响

4．4本章小结

5 微生物菌群结构调整对甘油代谢的影响

5．1 引言

5．2材料与方法

5．2．1 实验试剂

5．2．2 实验仪器

5．2．3接种物

5．2．4培养基配制

5．2．5实验方法

5．2．6分析方法

5．3结果与讨论

5．3．1 不同浓度抗生素对微生物生长的影响

5．3．2抗生素对微生物菌群发酵性能的影响

5．3．3抗生素对微生物菌群结构组成的影响

5．3．4添加单菌对微生物菌群甘油代谢的影响

5．4本章小结

6结论与展望

6．1 结论

6．2创新点

6．3 展望

参考文献

攻读博士学位期间科研项目及科研成果

致谢

作者简介

附录