氮胁迫诱导的莱茵衣藻甘油酯代谢研究

摘要

脂质作为细胞生物膜结构的主要组分，对环境变化高度敏感，在微藻响应环境胁迫过程中发挥着重要作用。氮胁迫条件下藻细胞将进行全局代谢响应并积累储能化合物，如甘油三酯(TAG)，TAG积累途径包括叶绿体和内质网途径，与极性甘油酯密切相关，而极性甘油酯特异性分布于各种细胞器中。本论文以模式微藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)为研究对象，基于甘油酯组分析平台与完整叶绿体提取技术，系统阐明了氮胁迫不同时期内TAG积累与各极性脂的响应特征，研究了自养和兼养培养方式对TAG合成与各极性脂代谢的影响，对各极性脂在TAG积累不同阶段的贡献进行了评价。
　　建立了莱茵衣藻甘油酯组定性定量分析平台。首先利用TLC和GC确定了极性甘油酯种类及其脂肪酸组成，再利用UPLC-ESI-Q-Trap/MS的一级质谱扫描和UPLC-ESI-Orbitrap/MS2的二级碎片信息扫描，共鉴定出109种极性甘油酯分子，并通过外标法在UPLC-ESI-Q-Trap/MS的多级反应监测模式下对其中45种分子进行了靶向定量。此外基于中性脂TAG的含量与特征脂肪酸的相对或绝对含量之间的线性相关性，扩展了微藻TAG的快速定量方法。
　　针对胁迫条件下叶绿体提取困难导致微藻TAG积累机制无法从亚细胞水平深入研究的难点，首次从氮胁迫4h自养生长的莱茵衣藻中成功提取出完整叶绿体，建立了基于脂肪酸标志物的叶绿体完整度和纯度评价标准。亚细胞脂质组分析表明氮胁迫4h时TAG只在叶绿体外积累，甜菜碱脂DGTS和糖脂DGDG还分别存在于叶绿体内和叶绿体外区室，新合成的DGDG和DGTS主要在叶绿体外分别以DAG和酰基形式参与TAG的合成，叶绿体膜脂MGDG主要以DAG形式参与叶绿体外TAG的合成。
　　比较了自养和兼养生长的莱茵衣藻甘油酯组对氮胁迫的响应差异，发现两种培养方式下藻细胞各甘油酯含量及其脂肪酸组成差异不大。氮胁迫期间，各极性脂含量均先增加后减少，极性脂主要组分由MGDG转为DGDG和DGTS，流向极性脂的碳分配比例发生变化，0～4h和4～24h内分别主要流向DGDG和DGTS，而24～48h内碳流至极性脂的比例减小，这表明了新合成DGDG和DGTS在胁迫期间的重要调控作用。
　　兼养生长的莱茵衣藻在整个氮胁迫期间，源自其极性脂的多种PUFA在被合成的同时还通过MGDG、DGDG和DGTS向TAG持续转化，使得基于PUFA的极性脂转化途径对TAG积累的贡献度逐渐增加，其中DGDG和DGTS是对含多不饱和酰基TAG积累的主要贡献者。

目录

声明

摘要

图目录

表目录

缩词表

1 绪论

1．1 微藻及其应用概述

1．1．1微藻概述

1．1．2微藻的应用

1．2 微藻脂质组及其在脂质代谢研究中的应用

1．2．1微藻甘油酯概述

1．2．2微藻脂质组分析技术

1．2．3基于脂质组的微藻脂质代谢研究

1．3 逆境胁迫诱导的微藻TAG积累和极性脂代谢机制

1．3．1微藻TAG积累的胁迫诱导

1．3．2微藻TAG合成

1．3．3微藻亚细胞水平的TAG积累

1．3．4微藻极性脂代谢与TAG积累之间的关系

1．3．5微藻甘油酯重组及其代谢途径构建

1．4 本文主要研究思路与内容

2 莱茵衣藻甘油酯组分析平台的建立

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1实验材料与设备

2．2．2藻种培养

2．2．3生长指标、光合活性测定和元素分析

2．2．4脂肪酸分析

2．2．5 脂质提取

2．2．6脂质的TLC分离和各甘油酯酰基的定量分析

2．2．7脂质的HPLC分离

2．2．9基于LC-MS(／MS)的莱茵衣藻极性甘油酯分子定量分析

2．3 结果与讨论

2．3．1莱茵衣藻极性甘油酯组的定性定量分析

2．3．2基于特征脂肪酸的莱茵衣藻TAG定量方法的扩展

2．4 本章小结

3 短期氮胁迫内莱茵衣藻亚细胞水平的甘油酯代谢研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1实验材料与设备

3．2．2藻种预培养

3．2．3藻种的同步化培养与氮胁迫培养

3．2．4富氮和缺氮条件下莱茵衣藻叶绿体的提取过程

3．2．5莱茵衣藻叶绿体的质量鉴定与评价

3．2．6统计分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 莱茵衣藻完整叶绿体的提取

3．3．2氮胁迫下莱茵衣藻亚细胞水平的TAG积累与极性脂响应

3．4 本章小结

4 长期氮胁迫内自养和兼养生长的莱茵衣藻甘油酯代谢研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1实验材料与设备

4．2．2氮胁迫下莱茵衣藻的自养和兼养培养方式

4．2．3生长指标、光合活性测定和pH监测

4．2．4组分含量测定

4．2．5基于TLC和GC的甘油酯酰基定量分析

4．2．6统计分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 自养和兼养培养方式下莱茵衣藻生长、光合活性和生化组分的时序变化

4．3．2 自养和兼养培养方式下莱茵衣藻各甘油酯的响应变化

4．3．3 自养和兼养培养方式下莱茵衣藻主要甘油酯酰基组成的变化

4．4 本章小结

5 菜茵衣藻极性脂转化对TAG积累贡献作用的动态变化研究

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1实验材料与设备

5．2．2藻种的氮胁迫培养

5．2．3生长指标和光合活性测定

5．2．4生化组分测定和元素分析

5．2．5基于尼罗红荧光染色的油滴积累观察

5．2．6基于TLC和GC的甘油酯酰基定量分析

5．3．1氮胁迫对莱茵衣藻生长、光合活性和生化组分的影响

5．3．2氮胁迫诱导的莱茵衣藻各甘油酯含量的变化

5．3．3氮胁迫诱导的莱茵衣藻各甘油酯酰基组成的变化

5．3．4氮胁迫诱导的莱茵衣藻脂酰基在各甘油酯中分布的变化

5．3．5氮胁迫诱导的莱茵衣藻主要极性甘油酯分子的变化

5．3．6氮胁迫不同阶段莱茵衣藻极性脂对TAG积累的不同贡献作用

5．4 本章小结

6结论与展望

6．1 结论

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

附录

作者简介

攻读博士学位期间科研项目及科研成果

致谢