百合无症病毒16kDa蛋白分析、纯化及RNA沉默响应分析

摘要

百合无症病毒（LSV）是危害百合科植物主要病毒，属于香石竹潜隐病毒属（Carlavirus），该病毒寄主范围较窄，只侵染百合科植物，目前尚未有有效办法进行根治。LSV是单正链RNA病毒，全长8394bp，具有6个开放读码框，编码4个蛋白分别为RbRp,TGB1-3,CP,16kDa。其中LSV-16kDa是功能未知蛋白，查阅文献推测可能是基因沉默基因，与RNA沉默机制相关。本论文在前期研究的基础上，通过生物信息学和分子生物学等手段，分析LSV-16kDa蛋白与RNA沉默过程中关键蛋白的互作关系，进而阐明LSV-16kDa蛋白功能，为彻底根治LSV致病机理奠定基础。研究结果如下： 通过与韩国，日本，中国浙江等地LSV-16kDa序列Blast比对分析，LSV-16kDa非常保守，具有Carla4家族核酸结合功能域，说明在基因组中是关键功能基因。磷酸化分析得知其存在磷酸化调控的可能性，糖基化位点分析发现LSV-16kDa存在N-糖基化和O-糖基化位点；多重算法预测LSV-16kDa二级结构N端为α-helix-coil-α-helix结构。Swiss model网站同源建模，对建模结果进行质量评估，所建同源模型蛋白质空间分布合理。同源建模LSV-16kDa的N端结构域，为无规则卷曲连接的2段α-螺旋，该结果与多重算法计算结果一致。N端结构域的α-helix-loop-α-helix结构中碱性氨基酸位于2段α-螺旋上，可通过氢键及静电力与核酸结合，α-螺旋上的亮氨酸拉链结构可通过绞连，进一步与siRNA互作，推测LSV-16kDa具有沉默抑制子功能基础。 将关键位点碱性氨基酸进行突变，命名为LSV-Δ16kDa。将LSV-Δ16kDa，LSV-16kDa同时添加纯化标签，去除终止密码子，转入原核载体进行表达并优化表达条件，获得可溶的LSV-16kDa及LSV-Δ16kDa蛋白。通过Western Blot特异性分析证明所表达的蛋白为目标蛋白LSV-16kDa及LSV-Δ16kDa，使用层析镍柱将目标蛋白纯化。LSV-16kDa与绿色荧光蛋白融合构建入真核双源表达载体PBI121，转化入农杆菌GV3101。激光共聚焦显微镜观察LSV-16kDa定位于细胞核，此为沉默抑制子关键因素。生理检测发现受感染的植株，POD,SOD,PAL活性均迅速上调，以抵抗LSV-16kDa侵染；同时病程相关基因HSP90及PR1均上调表达，其中HSP90随侵染时间表达量上调；而PR1随侵染时间表达量下降。研究RNA沉默机制中关键基因发现，AGO和DCL均出现上调，AGO2比AGO1,AGO4响应较快；DCL2比DCL1,DCL3响应较快，推测AGO2，DCL2均为RNA沉默中与LSV-16kDa互作的关键通路。

目录

声明

引言

1文献综述

1.1 百合病毒危害

1.1.1 我国的百合产业发展现状

1.1.2 百合病毒病及其防治

1.2 百合抗病毒研究进展

1.2.1 百合病毒的主要研究方法

1.3 RNA沉默机制及抑制子概述

1.3.1 RNA沉默抑制机制与沉默机制中的小RNA

1.3.2 植物RNA沉默抑制的抗病毒功能

1.3.2 植物RNA沉默抑制关键蛋白DCL

1.3.3 植物RNA沉默抑制关键蛋白AGO

1.3.4 植物病毒沉默抑制子

1.4 研究目的和意义及内容

1.4.1 研究目的和意义

1.4.2 研究内容

2. LSV-16kDa序列分析及预测

2.1 实验主要材料

2.2 实验主要仪器

2.3 实验方法

2.3.1 LSV-16kDa序列比对与同源树分析及预测

2.3.2 LSV-16kDa序列提交Swiss-model进行同源建模

2.3.3 LSV-16kDa同源建模质量评估

2.4 实验结果与分析

2.4.1 LSV-16kDa属间比对及进化分析

2.4.2 LSV-16kDa地域比对

2.4.3. LSV-16kDa蛋白糖基化分析

2.4.4 LSV-16kDa磷酸化位点

2.4.5 LSV-16kDa蛋白抗原表位分析

2.4.6 LSV-16kDa序列二级结构多重比对

2.4.7 LSV-16kDa序列Swiss-model同源建模结果

2.4.8 LSV-16kDa同源模型质量评估

2.4.9 LSV-16kDa三级结构分析

2.5 讨论

2.6 小结

3. 构建突变体LSV-Δ16kDa及LSV-16kDa可溶蛋白表达及纯化

3.1 实验材料与试剂

3.1.1 实验主要材料

3.1.2 实验主要试剂

3.2 实验仪器

3.3 实验方法

3.3.1 LSV-Δ16kDa基因克隆

3.3.2 LSV-16kDa，LSV-Δ16kDa优化表达

3.3.3融合蛋白的Western blot检测

3.3.4 融合蛋白的纯化

3.4 实验结果与分析

3.4.1 融合基因pET28a-LSVΔ16kDa，pET28a-LSV-16kDa的构建

3.4.2 LSV-16kDa，LSV-Δ16kDa优化表达

3.4.3 WesternBlot检测LSV-16kDa,LSV-Δ16kDa

3.4.4 融合蛋白的纯化

3.5 讨论

3.6 小结

4 百合无症病毒LSV-16kDa细胞定位、生理及RNA沉默响应检测

4.1 实验主要材料与试剂

4.2 实验主要仪器

4.3 实验方法

4.3.1 瞬时表达载体PBI121-LSV-16kDaGFP构建

4.3.2 激光共聚焦显微镜检测LSV-16kDa亚细胞定位

4.3.3 百合无症病毒LSV-16kDa生理指标检测

4.3.4 百合无症病毒LSV-16kDa目标基因的qPCR

4.4 实验结果与分析

4.4.1 融合基因LSV-16kDaGFP扩增

4.4.2 双元表达载体PBI121-LSV-16kDaGFP构建

4.4.3 LSV-16kDa亚细胞定位检测

4.4.4 LSV-16kDa生理指标检测

4.4.5 LSV-16kDa侵染烟草目标基因的检测分析

4.5 讨论

4.6 小结

结论

展望

参考文献

附录A 质粒图谱

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢

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