百合无症病毒16kDa基因的克隆、原核表达及亚细胞定位

摘要

百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)属麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)，是侵染百合的主要病毒之一。该病毒能够被蚜虫以非持续性的方式或者被棉蚜以持续的方式传播。LSV是一种纤维状的病毒颗粒，长度约为640nm宽度约为17-18nm，基因组为正单链RNA分子，3'端含有Poly A尾巴，5'端有帽子结构，含有6个开放阅读框(ORE)，编码4个蛋白，依次为:RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，三基因盒蛋白(TGBp1，2，3)，衣壳蛋白(CP)和未知功能的16 kDa蛋白。本研究主要围绕病毒3'端未知功能的16 kDa蛋白展开的。本文主要研究LSV-16kDa蛋白的基本理化性质和结构特点对揭示LSV的致病机理有重要的作用。
　　本文采用RT-PCR法克隆出LSV-16kDa基因，得到了一个基因全长为423bp的cDNA序列，该序列编码140个氨基酸。为了研究LSV-16kDa蛋白的系统进化关系，我们将已测序获得的序列与从GeneBank上获取的5种不同地区病毒的DNA和氨基酸序列比对后发现，相似性分别高达97％～99％和89-99％，而且16kDa-DaLian与16kDa-India的相似性较高，表明这两个物种可能来自同一进化来源。此外，我们还研究LSV同属不同物种间的进化关系，我们选取GeneBank序列数据库中属于Carlaviruses属的12种与16kDa蛋白相似的氨基酸序列，系统进化分析表明16kDa-DL与Llv(Lilylatent virus)最接近。
　　针对未知功能的LSV-16kDa蛋白的物理化学性质进行生物信息学分析表明:该蛋白的等电点为9.89，蛋白分子量为16194.8，有11个负电荷残基，24个正电荷残基，原子数为2288。LSV-16kDa为亲水性较强的蛋白;其二级结构有2α螺旋和3个延伸链，不存在信号肽结构，为非分泌型蛋白;其氨基酸序列中含有一个典型的调节病毒转录的Carla C4超蛋白家族，该Carla C4保守区域位于16kDa蛋白的第28～117位氨基酸，全长为91，Bit Score:109.39，E-value:2.02e-31.疏水性分析表明它是一个亲水性蛋白。卷曲结构主要出现在N端C端和两个螺旋之间。我们利用I-TASSER预测LSV-16kDa蛋白的三维结构。
　　通过IPTG进行诱导表达并利用SDS-PAGE进行检测，目的菌液中有明显的特异性条带，大小为45kDa(含有29kDa的GST标签)，说明16kDa蛋白得到大量的表达。最佳的原核表达条件是当温度为30℃、IPTG浓度为0.1-0.5mmol/L、诱导6h时，这时GST-16kDa融合蛋白以可溶性形式表达量较多，以包涵体形式表达量较少;经Bradford法测定其蛋白浓度为0.65 mg/mL。以上的结果为LSV-16kDa蛋白抗体的制备、蛋白功能分析以及LSV致病机理的研究奠定了基础。
　　我们利用生物信息学软件分析LSV-16kDa蛋白的亚细胞定位分布情况，并利用瞬时侵染的方法和荧光定位法观察16kDa与GFP融合蛋白在洋葱内表皮细胞中的定位情况，实验表明，融合蛋白16kDa-GFP和GFP-16kDa位于细胞核中并且均匀的分布于整个细胞核中。

目录

声明

摘要

引言

1 文献综述

1．1 百合病毒病概述

1．1．1 百合病毒的危害

1．1．2 百合病毒的防治方法

1．1．3 百合病毒的检测方法

1．2 百合无症病毒的研究进展

1．2．1 百合无症病毒的生物学特性

1．2．2 百合无症病毒的病害流行学研究

1．3 百合无症病毒的分子生物学研究

1．3．1 百合无症病毒基因组

1．3．2 LSV编码蛋白的功能

1．4 病毒末端结合蛋白16kDa的研究进展

1．5 本研究的目的与意义

2 LSV-16kDa的克隆及序列分析

2．1 材料与试剂

2．1．1 植物材料

2．1．2 病株和载体质粒

2．1．3 主要实验试剂

2．1．4 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 百合叶片总RNA的分离与提取

2．2．2 LSV-16kDa片段的获得

2．2．3 重组质粒的克隆及检测

2．2．4 克隆片段LSV-16kDa序列的测定

2．3 结果与分析

2．3．1 提取百合叶片的总RNA

2．3．2 应用RT-PCR方法获得目的片段

2．3．3 重组质粒PCR检测

2．3．4 重组质粒双酶切反应检测

2．3．5 克隆片段序列的测定结果

2．3．6 LSV序列分析

2．4 讨论

2．5 小结

3 LSV-16kDa分析与蛋白结构预测

3．1 实验方法

3．1．1 LSV-16kDa基本理化性质预测

3．1．2 LSV-16kDa功能结构域预测

3．1．3 LSV-16kDa疏水性预测

3．1．4 LSV-16kDa二级结构预测

3．1．5 LSV-16kDa卷曲螺旋结构预测

3．1．6 LSV-16kDa蛋白信号肽预测

3．1．7 LSV-16kDa蛋白亚细胞定位预测

3．1．8 LSV-16kDa三级结构预测

3．2 结果与分析

3．2．1 LSV-16kDa蛋白理化性质分析

3．2．2 LSV-16kDa功能结构域分析

3．2．3 LSV-16kDa疏水性分析

3．2．4 LSV-16kDa二级结构分析

3．2．5 LSV-16kDa卷曲结构分析

3．2．6 LSV-16kDa信号肽分析

3．2．7 LSV-16kDa亚细胞定位分析

3．2．8 LSV-16kDa结构域三级结构分析

3．3 讨论

3．4 小结

4 LSV-16kDa融合蛋白的原核表达

4．1 实验材料与试剂

4．2 实验方法

4．2．1 原核表达载体pGEX-16kDa的构建

4．2．2 pGEX-16kDa融合蛋白诱导表达及检测

4．2．3 pGEX-16kDa融合蛋白的可溶性表达

4．2．4 pGEX-16kDa蛋白大量表达纯化

4．3 结果与分析

4．3．1 原核表达载体的构建

4．3．2 pGEX-16kDa融合蛋白的小量诱导表达及检测

4．3．3 pGEX-16kDa融合蛋白的可溶性分析

4．3．4 pGEX-16kDa蛋白大量表达纯化

4．4 讨论

4．5 小结

5 LSV-16kDa蛋白的亚细胞定位

5．1 实验材料与试剂

5．2 实验仪器

5．3 实验方法

5．3．1 瞬时表达载体pTF-GFP、pTF-16kDa-GFP和pTF-GFP-16kDa的构建

5．3．2 16kDa蛋白的亚细胞定位

5．4 结果与分析

5．4．1 瞬时表达载体的构建

5．4．2 16kDa基因的亚细胞定位

5．5 讨论

5．6 小结

6 结论与展望

结论

展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢