海洋噬菌蛭弧菌分离鉴定及培养条件优化研究

摘要

近年来，由致病菌导致的大规模水产养殖病害频繁发生，不仅给渔民带来了经济损失，也严重阻碍了养殖业的发展。如何改善水产养殖环境、优化养殖模式，已成为世界各国水产养殖业共同关注的问题。抗生素等药物虽是疾病防治较为有效手段，但由于抗生素的滥用，导致致病菌对抗生素出现抗性且预演愈烈，开发研制新型抗生素不但费用高昂且研制周期长。噬菌蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)是一类体形较小，广泛分布于海水、污水、土壤等生境，运动活泼的革兰氏阴性菌;具有“寄生”和“裂解”宿主菌的生物学特性[1]，不仅不会导致细菌出现抗性，且没有噬菌体宿主过于专一的缺点，因此利用蛭弧菌进行水质净化、消除病原菌，将蛭弧菌应用于水产养殖业，具有良好的发展前景。
　　 本文研究蛭弧菌的分离、鉴定，考察蛭弧菌在淡水和海水水体环境下对致病菌的裂解活性，并进行了蛭弧菌裂解条件的优化。本文从大连某两处取污水，作为蛭弧菌样品，通过传代培养进行分离纯化，利用16S rDNA技术进行鉴定，序列比对结果表明两样品与Bdellovibrio bacteriovonus DSM50705的相似性为100％，即两水样中的噬菌蛭弧菌均为Bdellovibrio sp.208。本文通过双层平板法、液体裂解两种方法验证了蛭弧菌在淡水环境下的活性，传代培养验证蛭弧菌后代的活性。通过液体裂解法，考察得知Bdellovibrio sp.208在海水水体环境下仍有较高的活性。
　　 考察了蛭弧菌Bdellovibrio sp.208裂解宿主E.Coli JM109的最优条件:摇床与静止培养，以高供氧条件对Bdellovibrio sp.208裂解E.Coli JM109有促进作用;温度（30℃和37℃）对Bdellovibrio sp.208的裂解活性无明显影响;NaCl浓度为1.5％的组别裂解活性最高;pH为7时Bdellovibrio sp.208有最高的裂解效率，偏酸环境较碱性环境更适合Bdellovibrio sp.208裂解宿主;谷氨酸钠对Bdellovibrio sp.208裂解E.Coli JM109有抑制作用;Ca2+、Mg2+对Bdellovibrio sp.208的裂解能力有促进作用。在海水培养条件下，Bdellovibrio sp.208仍然具有活性。
　　 本研究对噬菌蛭弧菌样品裂解致病菌做了初步考察，分离了具有高裂解率、高繁殖率并适合海水环境的菌株。对于提高噬菌蛭弧菌的裂解活性并应用于海洋水质净化具有良好的理论研究意义。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 噬菌蛭弧菌简介

1．2 蛭弧茵生态与生境

1．3 蛭弧菌的分类

1．4 蛭弧菌的生长周期及其生理

1．4．1 蛭弧菌的生长周期

1．4．2 蛭弧菌的生理

1．5 蛭弧茵的培养和保藏方法

1．5．1 常规培养

1．5．2 大量培养

1．5．3 同步培养的单周期增殖

1．5．4 提前从蛭质体中释放

1．5．5 溶解酶浓缩液的制备

1．5．6 蛭弧菌的保藏

1．6 蛭弧菌的裂解谱

1．7 蛭弧菌的应用

1．7．1 蛭弧菌在水产养殖中的应用

1．7．2 蛭弧菌在净化水体方面的应用

1．7．3 蛭弧菌作为水体污染的指标

1．7．4 蛭弧菌在食品工业中的应用

1．8 本论文的目的、意义及内容

第2章 蛭弧菌的分离、鉴定

2．1 实验材料和仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 蛭弧菌的分离

2．2．2 噬菌蛭弧菌16S rDNA的引物设计

2．2．3 噬菌蛭弧菌特异性16S rDNA PCR反应

2．2．4 琼脂糖凝胶电泳

2．2．5 PCR产物的DNA测序

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 蛭弧菌分离

2．3．2 16S rDNA PCR电泳图

2．3．3 测序结果及BLAST比对结果

第3章 Bdellovibrio sp．208在淡水和海水环境下对宿主的裂解

3．1 实验材料和仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 蛭弧菌在淡水水体环境下的活性

3．2．2 蛭弧菌在海水水体环境下的活性

3．3 实验结果及分析

3．3．1 蛭弧菌在淡水水体环境下的活性

3．3．2 蛭弧菌在海水水体环境下的活性

第4章 蛭弧菌裂解条件的优化实验

4．1 实验材料和仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 供氧对Bdellovibrio sp．208裂解E．ColiJM109的影响

4．2．2 温度对Bdellovibrio sp．208裂解E．Coli的影响

4．2．3 NaCl浓度对Bdellovibrio sp．208裂解E．Coli的影响

4．2．4 pH对Bdellovibrio sp．208裂解E．Coli的影响

4．2．5 谷氨酸钠对Bdellovibrio sp．208裂解E．Coli的影响

4．2．6 Ca2+对Bdellovibrio sp．208裂解E．Coli的影响

4．2．7 Mg2+对Bdellovibrio sp．208裂解E．Coli的影响

4．3 实验结果及分析

4．3．1 供氧对Bdellovibrio sp．208裂解E．Coli的影响

4．3．2 温度对Bdellovibrio sp．208裂解E．Coli的影响

4．3．3 NaCl浓度对Bdellovibrio sp．208裂解E．Coli的影响

4．3．4 pH对Bdellovibrio sp．208裂解E．Coli的影响

4．3．5 谷氨酸钠对Bdellovibrio sp．208裂解E．Coli的影响

4．3．6 Ca2+对Bdellovibrio sp．208裂解E．Coli的影响

4．3．7 对Bdellovibrio sp．208裂解E．Coli的影响

4．3．8 优化条件下Bdellovibrio sp．208裂解E．Coli

结论

参考文献

致谢

作者简介