大胚龄人脑神经干细胞的分离培养及诱导分化的研究

摘要

目的 1．探讨大胚龄人脑神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的分离及培养方法。 2．探讨骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)对NSCs分化的影响。 方法 1．从16-20周胚龄胎脑室下区分离组织，采用机械法获得单细胞悬液，台盼蓝染色计数细胞存活率。 2．采用无血清培养基(DMEM／F<,12>)，加入2％B<,27>、EGF和bFGF培养NSCs，倒置显微镜下观察细胞的增殖情况；采用机械法分离法传代NSCs；采用免疫细胞荧光法检测神经上皮干细胞蛋白(nestin)及分化后神经细胞抗原的表达。 3．采用密度梯度离心结合贴壁分离法分离、纯化人BMSCs。 4．将人BMSCs和NSCs在体外通过不同的方式混合培养，实验分为三组：自然分化组、直接接触混合培养组及Transwell共培养组。观察BMSCs对NSCs分化的影响。采用免疫细胞荧光法及Western blot法检测各组神经元和星形胶质细胞标志物的表达。 结果 1．采用机械法从胎脑室下区获得的单细胞悬液，台盼蓝染色显示细胞存活率80％左右。 2．NSCs原代培养时，镜下见单个细胞呈贴壁生长。在生长因子EGF和bFGF的刺激下，2天后细胞分裂增殖形成3—5个细胞聚成的团块。随着团块直径增大，逐渐形成形态规则的神经球，并呈悬浮生长，球周边不断有分裂增殖的细胞凸出。7—10天后，球体积不断增大，细胞应予传代。直径大于200μm左右的神经球，球中央的细胞因得不到营养球而逐渐变黑。细胞传代时，用移液器将大的神经球机械吹打成微球后，分瓶继续培养。 3.免疫细胞荧光法鉴定神经干细胞球中大部分为Nestin表达阳性细胞。当神经球贴壁后，分化细胞就逐渐从球中向周边爬出。免疫荧光染色显示，胞体小、折光性强、突起少而长的细胞胞浆神经元标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)染色呈阳性，此类细胞占细胞总数的(17.4±4.9)％；胞体较大、胞浆丰富、形态多样、突起数目多而粗大的细胞胞浆星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色呈阳性，此类细胞占细胞总数的(71.1±9.9)％；另有少量细胞胞浆少突胶质细胞标志物2'，3'-环腺苷酸-3'-磷酸二酯酶(CNPase)染色呈阳性。 4.分离得到的BMSCs经贴壁筛选后，呈现较均一梭形形态，保持较强的增殖能力。 5.直接接触共培养组与自然分化组和Transwell共培养组相比，神经干细胞球中神经细胞的迁移明显加快，迁移的距离更远。在直接接触共培养组和Transwell共培养组中，镜下见胞体小、折光性强的神经元样细胞较自然分化组显著增多，而胞体较大、形态多样的星形胶质样细胞明显减少。细胞免疫荧光染色显示直接接触共培养组和Transwell共培养组中，NSE阳性细胞率分别为(42.2±8.3)％和(38.5±7.7)％，明显高于自然分化组的(17.4±4.9)％，p<0.01；GFAP阳性细胞率分别为(38.1±6.9)％和(40.3±8.2)％，明显低于自然分化组的(71.1±9.9)％，p<0.01；直接混合培养组与Transwell共培养组之间比较无统计学差异。Western blot检测结果显示，Transwell共培养组中NSE蛋白表达量显著高于自然分化组，而GFAP蛋白表达量低于自然分化组，p<0.05。 结论 1.从16-20周胚龄人胎脑室下区成功分离、培养NSCs。 2.BMSCs具有促进NSCs向神经元分化的作用。

目录

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前言

材料与方法

实验结果

讨论

总结

参考文献

致谢

附图

综述 神经干细胞增殖与分化调控机制的研究进展