高产纤维素酶菌株的分离鉴定、诱变选育及产酶条件的研究

摘要

从江西传统发酵食品中分离目标菌株(实验室已有研究)，利用稀释涂平板和显微单孢子分离相结合方法分离出大量单孢子，再对单孢子进行培养得到数株发育成熟的单孢子菌株，通过筛选得到产酶活力最高的菌株NC-1-6，采用形态鉴定和分子生物学鉴定相结合的方法鉴定该菌株为粗壮脉纹孢菌。 研究了菌株NC-1-6以稻草为唯一碳源时，稻草浓度、发酵温度及培养基初始pH值对整个生长周期内菌体生长和发酵产酶的影响。研究发现：稻草降解率与菌体生长状况呈正相关，2％浓度时，菌体生长最佳，稻草降解率也最高。菌体生长与产酶的最佳稻草浓度、最适pH值及最适温度均不一致。菌体生长的最佳稻草浓度为2％，产酶最佳稻草浓度为5％；菌体生长最适初始pH值为5.5，产酶最适初始pH值为4.8；菌体生长最适温度是先用25℃培养3 d再用30℃，产酶最适温度是固定30℃。 为了进一步提高产酶能力，以粗壮脉纹孢菌的野生株为出发菌株，通过紫外线和硫酸二乙酯的处理得到突变株60D7253。分别研究了各诱变剂量与致死率和正变率的关系。菌株的筛选分为初筛和复筛：初筛是测定透明圈直径与菌落直径的比值(HC值)，复筛测定发酵液的滤纸酶活(FP酶活力)和内切酶酶活(Cx酶活力)。突变株60D7253酶活力比出发株有较大提高，提高幅度分别为：FPA提高179.25％、Cx酶活力提高175.99％、C1酶活力提高147.2％、βG酶活力提高3.83％。 本文还对突变株60D7253发酵产酶培养基和培养条件进行了优化。优化后的培养基和培养条件为：选用浓度为5％的玉米芯为碳源，以浓度为0.42％的黄豆粉为氮源，添加改良的Mandels营养液和0.1％Tween80，培养基初始pH为5.5，培养温度为28℃，以3％的接种量接种萌发了36 h的孢子悬液，装液量为50mL/250 mL，转速为160 r/min，培养时间为6 d。研究表明，突变株与出发株最适培养温度和最适初始pH值不相一致，且突变株比出发株纤维素酶复合物各酶活力高峰值出现晚一天。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词

声明

第1章引言

1.1研究背景

1.2纤维素的降解

1.3产纤维素酶的微生物

1.3.1粗壮脉纹孢菌产纤维素酶的研究进展

1.4产纤维素酶菌株的诱变选育

1.4.1诱变作用机理

1.4.2剂量的选择

1.4.3影响诱变效果的因素

1.4.4高产突变菌株的筛选

1.4.5纤维素酶菌种选育情况

1.5纤维素酶的酶系组成、作用机理及分子结构

1.5.1纤维素酶的组成

1.5.2纤维素酶的作用机理

1.5.3纤维素酶的结构与作用机制

1.6纤维素酶活力的测定方法

1.6.1纤维素酶的测定方法

1.6.2测定原酶液中单一组分纤维素酶活力的方法简介

1.7本实验研究的意义及主要内容

1.7.1研究意义

1.7.2主要研究内容

第2章优良出发株的分离、纯化与鉴定

2.1材料与方法

2.1.1主要试剂

2.1.2主要仪器

2.1.3培养基

2.1.4采样

2.1.5稀释涂布分离和简易单孢子分离

2.1.6平板筛选

2.1.7摇瓶培养

2.1.8测定方法

2.1.9菌种形态特征鉴定

2.1.10显微镜下形态特征观察

2.1.11霉菌18Sr DNA提取

2.1.12 18SrDNA的PCR扩增

2.1.13 PCR产物序列测定及序列分析

2.2结果与分析

2.2.1葡萄糖工作曲线

2.2.2分离、纯化及筛选结果

2.2.3菌株NC-1-6的形态观察

2.2.4纤维素分解菌NC-1-6 18SrDNA PCR扩增和序列分析

2.3讨论

2.3.1菌株的分离纯化

2.3.2同种不同株间纤维素酶酶活力的差异性

2.3.3菌种鉴定

第3章菌株NC-1-6产酶和生长过程中的影响因素研究

3.1材料与方法

3.1.1主要试剂与原料

3.1.2菌种

3.1.3培养基

3.1.4主要仪器

3.1.5酶活测定方法

3.1.6蛋白测定方法

3.1.7稻草降解率的测定及计算方法

3.1.8不同稻草浓度对菌体生长和纤维素酶活力的影响

3.1.9不同初始pH值对菌体生长和纤维素酶活力的影响

3.1.10不同发酵温度对菌体生长和纤维素酶活力的影响

3.2结果与分析

3.2.1牛血清白蛋白工作曲线

3.2.2不同稻草浓度对菌体生长和纤维素酶活力的影响

3.2.3不同初始pH值对菌体生长和纤维素酶活力的影响

3.2.4不同温度对菌体生长和纤维素酶活力的影响

3.3讨论

3.3.1温度对粗壮脉纹孢菌产酶的影响

3.3.2粗壮脉纹孢菌对纤维的降解利用

3.3.3稻草浓度对产酶的影响

3.3.4菌体生长与产酶的关系

第4章菌株NC-1-6的诱变选育

4.1材料与方法

4.1.1主要试剂与原料

4.1.2菌种

4.1.3培养基

4.1.4主要仪器

4.1.5斜面菌种的活化

4.1.6孢子出芽实验

4.1.7孢子悬液制备

4.1.8紫外诱变

4.1.9硫酸二乙酯诱变

4.1.10复合诱变

4.1.11二次平板初筛

4.1.12一次复筛

4.1.13分离纯化

4.1.14二次复筛

4.1.15酶活力测定方法

4.1.16突变株的传代稳定性

4.1.17突变株60D7Z53与出发株的比较

4.2结果与分析

4.2.1孢子出芽实验

4.2.2紫外诱变、DES诱变及复合诱变的致死率和正变率

4.2.3第二次平板初筛

4.2.4第一次复筛

4.2.5酶活力对数与HC的线性分析

4.2.6第二次复筛

4.2.7突变株传代稳定性

4.2.8突变株60D7Z53与出发株比较

4.3讨论

4.3.1酶活力对数与HC值间的线性关系分析

4.3.2单因素和复合因素的诱变机理与诱变效果

4.3.3突变株在筛选过程中衰退

第5章突变株60D7Z53产酶培养基和产酶条件的优化

5.1材料与方法

5.1.1主要试剂与原料

5.1.2菌种

5.1.3培养基

5.1.4主要仪器

5.1.5斜面菌种的活化

5.1.6孢子悬液制备

5.1.7培养基组成对突变株60D7Z53所产纤维素酶系酶活力的影响

5.1.8培养条件对突变株60D7Z53所产纤维素酶系酶活力的影响

5.1.9测定方法

5.2结果与分析

5.2.1培养基组成对突变株60D7Z53所产纤维素酶系各酶活力的影响

5.2.2培养条件对突变株60D7Z53所产纤维素酶系酶活力的影响

5.3讨论

5.3.1突变株60D7Z53液体发酵产酶条件的优化

5.3.2碳源对突变株60D7Z53所产纤维素酶系各酶活力的影响

5.3.3氮源对突变株60D7Z53所产纤维素酶系酶活力的影响

5.3.4碳氮比对突变株60D7Z53所产纤维素酶系酶活力的影响

5.3.5添加Mandels营养盐对60D7Z53所产纤维素酶系酶活力的影响

5.3.6添加Tween80对突变株60D7Z53所产纤维素酶系酶活力的影响

5.3.7培养温度对突变株60D7Z53所产纤维素酶系酶活力的影响

5.3.8初始pH值对突变株60D7Z53所产纤维素酶酶活力的影响

5.3.9摇床转速对突变株60D7Z53所产纤维素酶系酶活力的影响

5.3.10种龄和接种量对突变株60D7Z53所产纤维素酶系酶活力的影响

第6章结论及展望

6.1结论

6.1.1优良出发株的分离、纯化与鉴定

6.1.2菌株NC-1-6产酶和生长过程中的影响因素研究

6.1.3菌株NC-1-6的诱变选育

6.1.4突变株60D7Z53产酶培养基和产酶条件的优化

6.2进一步的工作方向

创新之处

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢

附录