盐酸克仑特罗ELISA方法的建立及用噬菌体展示技术筛选其模拟表位

摘要

盐酸克仑特罗(Clenbuterol，CLB)，俗称瘦肉精，是一种β<,2>-肾上腺素受体激动剂。作为治疗哮喘药物已经有30多年了。不幸的是这类药物被非法用来作为家畜的生长促进剂，用以改善营养物质在脂肪和肌肉之间的重新分配，增加瘦肉。这种非法应用会对食用残留有此类药物畜产品的消费者产生毒害作用，给人民的身体健康和生命安全造成潜在的危害。因此，世界上许多国家都禁止在畜牧业上使用盐酸克仑特罗。为了防止对人类的危害，必须建立快速、灵敏、有效的检测方法。ELISA方法检测盐酸克仑特罗残留是一种快捷、可靠的方法，可在实际检测中应用。噬菌体肽库展示技术近年来发展很快，可以用来淘选CLB替代抗原的模拟表位。这也为其它小分子半抗原物质的ELISA方法的建立提供新的思路。 本论文主要包含两部分内容： 1 建立盐酸克仑特罗间接竞争ELISA检测方法。 2 用噬菌体肽库展示技术淘选盐酸克仑特罗替代抗原的模拟表位。 第一部分包括盐酸克仑特罗偶联抗原的合成，单克隆抗体的纯化和效价的测定，ELISA各个影响因素最佳条件的优化，该ELISA方法性能的评价等。根据实验建立了盐酸克仑特罗间接竞争ELISA检测方法，包被偶联抗原为0.5ng/mL，加入CLB单抗原液稀释为1:250000，酶标二抗原液稀释为1:5000。其间接竞争标准曲线其线性范围为0.38-50ng/mL，IC<,50>为6.25ng/mL，检测下限为0.19ng/mL。曲线方程为y=35.149x+19.145，R=0.99378。批内和批间的变异系数分别为8.3％和9.97％。进行样品加标回收实验，平均回收率为93.14％。 第二部分包括以抗CLB的单克隆抗体为靶分子，从噬菌体随机7肽库中进行4轮亲和淘选。从第4轮噬菌平板上随机挑选18个噬菌斑，经间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定，挑选出6个合适的噬菌体。经测序可知其序全列为N-His-His-Thr-Phe-Phe-Lys-His-C。用噬菌体P8替代CLB抗原建立了间接竞争ELISA标准曲线，并用该噬菌体进行样品加标回收实验。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略语

声明

第1章引言

1.1盐酸克仑特罗ELISA检测方法的研究进展

1.1.1盐酸克仑特罗的研究进展

1.1.2免疫酶联吸附试验(ELISA)技术的研究进展

1.1.3人工抗原偶联方法的研究

1.2噬菌体肽库展示技术的研究进展

1.2.1噬菌体展示技术的定义

1.2.2噬菌体肽库的发展

1.2.3噬菌体肽库展示技术的应用

1.3主要研究内容

第2章盐酸克仑特罗ELISA方法的建立

2.1实验材料

2.2仪器和设备

2.3主要溶液的配制

2.4实验方法

2.4.1样品预处理

2.4.2 CLB偶联抗原的制备

2.4.3 CLB单克隆抗体的纯化

2.4.4 CLB单克隆抗体效价的测定

2.4.5酶标板均一性的测定

2.4.6 ELISA单因素分析

2.5结果与讨论

2.5.1 CLB偶联抗原偶联比的计算

2.5.2 CLB单克隆抗体效价的计算

2.5.3酶标板均一性的评价

2.5.4最佳抗原包被浓度和最佳单抗稀释倍数的确定

2.5.5最佳酶标二抗稀释倍数的确定

2.5.6洗涤液(PBST)中最佳Tween-20浓度的确定

2.5.7封闭液最佳条件的确定

2.5.8盐酸克仑特罗间接竞争ELISA方法的最佳操作条件

2.5.9盐酸克仑特罗间接竞争ELISA方法的性能评价

2.6小结

第3章噬菌体展示技术筛选盐酸克仑特罗的模拟表位

3.1实验材料

3.2仪器和设备

3.3主要溶液的配制

3.4实验方法

3.4.1 ER2738菌株的保藏与活化

3.4.2噬菌体的第一轮亲和淘选

3.4.3第一轮淘选噬菌体的扩增和纯化

3.4.4洗脱物和扩增产物的滴度测定

3.4.5噬菌体的第二轮淘选

3.4.6噬菌体的第三轮淘选

3.4.7噬菌体的第四轮淘选

3.4.8噬菌斑的扩增和纯化

3.4.9噬菌体滴度测定

3.4.10 CLB模拟表位的鉴定

3.4.11阳性噬菌体克隆DNA的提取

3.4.12琼脂糖凝胶电泳鉴定噬菌体DNA

3.4.13以CLB模拟表位建立竞争ELISA标准曲线

3.4.14样品加标回收实验

3.5实验结果

3.5.1噬菌体富集效果

3.5.2间接非竞争ELISA鉴定阳性噬菌体克隆

3.5.3间接竞争ELISA筛选CLB模拟表位

3.5.4阳性克隆噬菌体基因组DNA电泳及DNA核心序列分析

3.3.5以CLB模拟表位建立间接竞争ELISA标准曲线

3.5.6样品加标回收结果

3.6影响因素分析

3.6.1去污剂的浓度

3.6.2靶分子抗体的浓度

3.6.3温育结合温度

3.6.4结合和洗脱时间以及淘选轮数

3.6.5噬菌体文库的选择

3.7小结

第4章结论与展望

4.1结论

4.2研究与展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果