水稻Bel基因异源表达特性分析及基因打靶载体构建

摘要

水稻Bel基因编码的细胞色素P450单加氧酶CYP81A6对除草剂苯达松具有抗性作用,对该P450基因进一步深入地研究为将其应用于提高农作物的抗除草剂性能奠定了基础。同时采用基因打靶技术对水稻.Bel基因进行定点敲除,能有效地获得苯达松敏感致死株。本研究将水稻Bel基因转入烟草和番茄基因组中进行表达,对不同抗性的转基因植株从表型和RNA水平进行分析,同时构建了对Bel基因进行打靶的载体plNA134-Phpt。主要结果如下:
　　 1.将实验室己有的Bel基因表达载体pKYL71-Bel转化入烟草和番茄基因组并进行表达。对70株Kan抗性转基因烟草进行PCR扩增,54株检测为阳性,转化效率为77％；对50株Kan抗性转基因番茄DNA进行PCR扩增,37株检测为阳性,转化效率为74％。
　　 2.对转基因烟草和番茄进行苯达松叶盘筛选和成株检测,编号为1号和13号的转基因烟草对浓度为0.25％苯达松具有抗性。编号为3号、23号和29号的转基因番茄对浓度为0.05％苯达松具有抗性。
　　 3.以β-actin为内参,利用半定量RT-PCR技术对其表达特性进行了研究,结果表明不同苯达松抗性的转基因植株在mRNA表达水平上也存在相应表达量的变化。
　　 4.对水稻品种C418愈伤诱导及外植体分化的培养基进行优化。结果表明当2,4-D为3 mg/L,酵母粉为6 g/L,水解酪蛋白为0.6 g/L时C418的综合培养能力系数最高。其中,2,4-D对水稻愈伤培养性状影响显著(P<0.05),水解酪蛋白和酵母粉对水稻愈伤培养性状影响不显著。
　　 5.构建水稻Bel基因打靶表达载体plNA134-Phpt,与Bel区域同源的左右臂长度分别为891bp和695bp,载体上含有潮霉素正向选择标记和白喉毒素负向选择标记。

目录

文摘

英文文摘

第1章 引言

1.1 水稻苯达松敏感致死突变材料及其突变基因定位

1.1.1 水稻苯达松敏感致死突变材料研究进展

1.1.2 Norin 8m中bsl基因定位的研究

1.1.3 8077S中bel基因定位的研究

1.1.4 CYP81A6基因的图位克隆和功能鉴定

1.2 细胞色素P450

1.2.1 细胞色素P450的一般特征

1.2.2 植物中与除草剂代谢相关P450酶系研究进展

1.2.3 植物中P450对除草剂的代谢机理

1.2.4 P450酶系的应用

1.3 基因打靶

1.3.1 基因打靶研究概述

1.3.2 基因打靶机制

1.3.3 基因打靶过程

1.3.4 基因打靶的应用

1.4 选题依据

第2章 Bel基因转烟草和番茄表达分析

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2 结果与分析

2.2.1 转基因烟草和番茄植株的获得

2.2.2 转基因烟草和番茄PCR检测

2.2.3 转基因烟草和番茄的叶盘筛选

2.2.4 转基因烟草和番茄成株检测

2.2.5 转Bel烟草和番茄半定量RT-PCR

2.3 讨论

2.3.1 Bel基因的利用价值

2.3.2 8d基因在转基因烟草和番茄中表达量的探讨

2.3.3 半定量RT-PCR扩增

第3章 水稻培养基条件的优化

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 方法

3.2 结果分析与讨论

3.2.1 胚性愈伤组织的诱导

3.2.2 愈伤组织的分化培养

3.2.3 各培养性状的遗传

第4章 水稻Bel基因打靶载体的构建

4.1 实验材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 方法

4.2 结果与分析

4.2.1 hpt基因与pMD18-T-P450载体的连接及转化

4.2.2 pMD18-T-Phpt载体的不完全酶切

4.2.3 Bel-hpt片段与piNA134表达载体的连接及转化

4.3 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果