白芍原植物种质资源遗传多样性的ISSR分析

摘要

白芍是我国著名的传统中药，为毛莨科芍药属植物芍药经去皮水煮加工后的干燥根，中国白芍栽培已有3900多年的历史。白芍长期以来就被作为多种中药和新药的主要原材料。本研究以浙江磐安产杭白芍为主要研究材料，并以安徽毫州，安徽芜湖，四川中江，山东菏泽等地白芍为对照，运用ISSR分子标记对磐安产杭白芍的种质遗传结构及药材道地性在遗传上的反映进行探讨，着重分析以花色为特征的种内变异，目的旨在为白芍种质资源的研究及育种工作奠定基础。主要研究方法和结果如下： 1．采用CTAB法提取了芍药基因组DNA，所提取的DNA的质量较高，经检测适于ISSR扩增反应。 2．建立了适于白芍ISSR-PCR扩增的最佳反应体系：总体积25μl，DNA模板约50ng，10×bufer2.5μl，primer0.3μmol·L<'-1>，四种dNTPs各0.25 mmol·L<'-1>，MgCl<,2>mol·L<'-1>，Taq DNA聚合酶1.25U．扩增反应的程序为：94℃预变性5 min，然后进行35个循环：94℃变性45 s，55～62℃复性45 s，72℃延伸1.5 min：循环结束后72℃延伸10 min，4℃保存。 3．采用了10个ISSR引物。物种水平上，多态位点百分率(PPB)平均为97.65％，期望杂合度(H<,s>)为0.3189、Shannon's指数(H<,0>)为0.4831；居群水平上，多态带百分率(PPB)从23.67％至63.89％不等，平均40.19％；等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、期望杂合度(H<,E>)0.1092，Shannon's指数(H<,0>)0.1840。以此可见，在物种水平或居群水平上，白芍均表现出较丰富的遗传多样性。其中，杭白芍的多样性最为丰富，平均多态率超过40％，个别居群多态率高达63.89％，可见磐安杭白芍居群遗传变异度较为丰富，可为选育白芍优良品种的提供物质基础。依据Nei's分析，白芍总的基因多样度(Ht)为0.3171，群体内的基因多样度(Hs)为0.1223，居群间的基因流(N<,m>)为0.3157，群间的遗传分化系数(Gst)为0.6130，表明白芍的遗传变异主要存在于不同的群体间，居群间的遗传变异占总遗传变异的61.3％，而居群内的遗传变异只有38.7％，表明居群间的遗传分化较大，遗传变异主要存在于居群间。 4．从POPFENE聚类分析可知，整体上，磐安杭白芍居群和外省居群分支明显，各属于两个不同的大分支，可见它们的遗传分化较大，亲缘关系较远。花色的遗传特性反映出和其产地有一定的关系。聚类图上第一组和第三组分别对应磐安居群的红花和外省居群的红花，虽然它们的花色同为红色系列，但亲缘关系却相距甚远，表明这两种红花系列的人工选育时间很可能较早。第二组中的粉红花均属于磐安居群，在亲缘关系上，与磐安居群的红花保持着差距。整体比较，磐安的杭白芍居群具有相当高的道地性，但是，部分居群在引种栽培上还存在着混乱。 综上所述，白芍的道地产区之间，道地与非道地产区之间的栽培品种都存在着遗传差异，这种差异可能是对同一野生居群长期人为地进行各种不同选择的结果。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章 引言

1.1我国白芍的研究概况

1.1.1白芍的形态特征及特性

1.1.2白芍的繁殖方式

1.1.3白芍的研究进展

1.1.4本研究的出发点和意义

1.2遗传多样性的理论研究、方法与应用

1.2.1遗传多样性的概念

1.2.2遗传多样性的表现形式

1.2.3遗传多样性的研究方法

1.3 DNA指纹技术在药用植物种质资源研究中的应用

1.3.1在品种鉴定上的应用

1.3.2在品种品质纯度检测上的应用

1.3.3在种质资源遗传多样性研究上的应用

1.3.4在种质资源遗传关系研究上的应用

第2章 材料与方法

2.1供试材料

2.2研究方法

2.2.1实验试剂及来源

2.2.2实验仪器及来源

2.2.3主要溶液配制

2.3自芍基因组DNA的提取

2.4 DNA浓度测定

2.5 ISSR-PCR扩增

2.5.1 ISSR反应体系及反应程序

2.5.2引物筛选

2.5.3电泳和拍照

2.6数据分析

2.6.1带的记录与数据矩阵的建立

2.6.2遗传多样性水平和居群遗传结构分析

2.6.3居群遗传关系的聚类分析

2.6.4遗传距离与地理距离的相关性检验

第3章 结果与分析

3.1 ISSR-PCR扩增条件优化

3.1.1 DNA的提取

3.1.2 Taq酶

3.1.3 DNA模板浓度

3.1.4 Mg2+浓度

3.1.5 dNTPs浓度

3.1.6退火温度

3.1.7正交实验确立ISSR-PCR条件

3.2 ISSR-PCR扩增结果

3.3 ISSR结果分析

3.3.1白芍的遗传多样性分析

3.3.2白芍的遗传结构分析

3.3.3居群间的遗传距离及遗传一致度

3.3.4居群遗传关系的聚类分析

第4章 讨论

4.1遗传变异在居群内和居群间的分布

4.1.1白芍种源植物的遗传多样性

4.1.2白芍种源遗传结构

4.1.3白芍不同居群间的遗传关系

4.2白芍的道地性与引种

4.3全面采集样品

第5章 结论与展望

5.2结论

5.2展望

致谢

参考文献

附录A

攻读学位期间的研究成果