人AE2基因的cDNA克隆及真核表达载体pcDNA3.1-wt-AE2的构建

摘要

目的:利用分子克隆技术克隆人野生型全长AE2 cDNA,构建出pcDNA3.1.wt-AE2重组表达质粒,进行测序鉴定,并检测该表达质粒对内皮细胞系HUVECs AE2基因表达的影响,为进一步研究AE2在疾病中的生物学功能提供物质基础。
　　 方法:
　　 1.用DMEM+10％FBS培养基培养人HeLa细胞,从HeLa细胞中提取总RNA；自行设计上下游各带有NheⅠ和HindⅢ限制性酶切位点的PCR引物,采用RT-PCR技术,将总RNA反转录成cDNA,再扩增出AE2基因全长cDNA片段。
　　 2.用限制性核酸内切酶NheⅠ和HindⅢ分别双酶切pcDNA3.1质粒和AE2cDNA片段,电泳分离后回收纯化两端带不同粘性末端的pcDNA3.1质粒和AE2cDNA片段；用T4DNA连接酶连接pcDNA3.1质粒和AE2片段,将连接产物转化入感受态细胞TOP10,在含有终浓度为50m/mlAmp的LB固体培养基中筛选培养24h后,挑取单个阳性菌落扩增,提取并纯化重组体质粒pcDNA3.1-wt-AE2。
　　 3.用三种方案的限制性核酸内切酶酶切鉴定所构建重组载体pcDNA3.1-wt-AE2,得出肯定结果后通过DNA测序进一步鉴定。
　　 4.将绿色荧光蛋白质粒pEGFP-N2转染HUVECs,观察24h、36h、48h及72h绿色荧光的表达量,确定转染效率的时效关系而推测重组质粒pcDNA3.1-wt-AE2的最佳转染时间。
　　 5.将重组质粒pcDNA3.1-wt-AE2转染HUVECs,随机分为三个组:正常对照(Control)组、转染空质粒pcDNA3.1组、转染重组质粒pcDNA3.1-wt-AE2组。通过RT-PCR和Western Blotting检测HUVECs中AE2 mRNA和蛋白表达情况。
　　 结果:
　　 1.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,在预期位置显示了清晰的亮带,这一结果提示已成功扩增出了特异性的目的基因AE2 cDNA。
　　 2.将分别双酶切后的pcDNA3.1质粒和AE2 cDNA片段用T4DNA连接酶进行连接反应后,转化感受态细胞TOP10,经Amp筛选,在培养皿上可见阳性菌落；挑取单个阳性菌落进行扩增并提取纯化出重组体质粒pcDNA3.1-wt-AE2。
　　 3.分别经限制性核酸内切酶NheⅠ单切,NheⅠ和HindⅢ双切,SacⅠ单切后,酶切图谱结果显示与预期相符；进一步将重组体进行基因测序分析,证实本实验克隆的人AE2基因cDNA序列与Genebank[NM003040]公布人AE2因cDNA序列一致,这一结果表明重组体pcDNA3.1-wt-AE2中插入的目的基因AE2为正向、单倍插入。
　　 4.将质粒pEGFP-N2转染HUVECs内皮细胞后,在绿色荧光显微镜可见到绿色荧光,且48h的转染效率高达40％。
　　 5.AE2 mRNA的表达:AE2各组样本均由对应的B-actin条带的扫描值标化。Control组、转染空质粒pcDNA3.1组、转染重组质粒pcDNA3.1-wt-AE2组AE2 mRNA表达量分别为0.32±0.03,0.34±0.03,0.90±0.12。AE2 mRNA在正常HUVECs中呈基础性表达；转染重组质粒pcDNA3.1-wt-AE2组HUVECs较Control组AE2 mRNA转录显著上调(P<0.001)；转染空质粒pcDNA3.1组与Control组相比无明显差异(P>0.05)。
　　 6.AE2蛋白的表达:AE2蛋白各组样本均由对应的β-actin蛋白条带的扫描值标化。Control组、转染空质粒pcDNA3.1组、转染重组质粒pcDNA3.1-wt-AE2组AE2蛋白表达量分别为0.25±0.04,0.28±0.04,1.89±0.05。AE2蛋白在J下常HUVECs中呈基础性表达；转染重组质粒pcDNA3.1-wt-AE2组内皮细胞较Control组AE2蛋白表达显著增加(P<0.01)；转染空质粒pcDNA3.1组与Control组相比较无明显差异(P>0.05)。
　　 结论:
　　 1.我们成功克隆了人AE2基因野生型全长cDNA序列,并构建pcDNA3.1-wt-AE2重组质粒真核表达载体。
　　 2.重组质粒pcDNA3.1-wt-AE2可明显升高HUVECs AE2基因在mRNA和蛋白水平的表达。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写及全文和中文对照表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 主要材料及试剂

2.1.1 细胞株、质粒来源

2.1.2 主要试剂和产地

2.1.3 主要仪器设备和产地

2.2 实验方法

2.2.1 HeLa细胞的培养

2.2.2 RT-PCR方法克隆人野生型全长AE2 cDNA序列

2.2.3 质粒pcDNA3.1的准备

2.2.4 基因重组技术

2.2.5 绿色荧光蛋白质粒pEGFP-N2转染HUVECs

2.2.6 重组体质粒pcDNA3.1-wt-AE2转染HUVECs

2.2.7 PCR法检测HUVECs AE2mRNA的表达

2.2.8 Western blotting法检测HUVECs AE2蛋白的表达

第三章 结果

3.1 RT-PCR扩增人AE2 cDNA

3.2 质粒PCDNA3.1的提取纯化

3.3 双酶切后质粒PCDNA3.1和AE2 CDNA片段的纯化

3.4 重组质粒PCDNA3.1-WT-AE2的酶切鉴定

3.5 重组质粒PCDNA3.1-WT-AE2的测序鉴定

3.6 重组质粒PCDNA3.1-WT-AE2在HUVECs细胞中表达

3.6.1 转染质粒pEGFP-N2观察绿色荧光

3.6.2 转染重组质粒上调HUVECsAE2 mRNA的表达

3.6.3 转染重组质粒上调HUVECs AE2蛋白的表达

第4章 讨论

4.1 AE2蛋白在高糖诱导内皮细胞凋亡中的作用

4.2 基因表达系统

4.3 长链PCR

4.4 不足之处

第5章 结论

参考文献

致谢

综述

参考文献

攻读学位期间的研究成果