牛磺酸对严重烧伤早期心肌损伤相关基因表达调控的研究

摘要

牛磺酸(Tau)是心肌中含量最丰富的游离氨基酸，具有抗炎和抗氧化等作用，是一种很好的内源性细胞保护剂。本课题组就牛磺酸对心肌的保护作用进行了系列研究，研究发现：①牛磺酸能降低烧伤大鼠心肌和血浆中TNF-α，从而降低炎症反应；②牛磺酸能清除自由基，调节胞内钙稳态，对心肌线粒体结构功能损伤有明显保护作用；③牛磺酸能调节凋亡相关基因表达而降低心肌细胞凋亡。为深入探讨牛磺酸对严重烧伤早期心肌损伤相关基因表达及其信号转导通路的影响，本课题设计通过细胞水平、分子生物学水平、动物实验三个层面，在以往的研究基础上，深入了解牛磺酸抗心肌细胞炎症/凋亡损伤、保护心肌细胞的作用及可能机制。该研究的完成可拓宽牛磺酸在临床上的应用，且可为严重烧伤早期如何保护心脏，减少心肌损害及恢复心功能提供新的思路和途径，推动烧伤后心肌损害防治药物的研究开发与应用。 第一部分：体外研究牛磺酸对心肌细胞损伤相关基因表达调控的研究 目的：在缺氧复合烧伤血清作用的心肌细胞上，观察不同缺氧时间段，HIF-1α、p38激酶、GRP94基因表达的变化及其与肌钙蛋白、TNF-α水平的相关性，并同时观察牛磺酸的影响。对比观察p38激酶抑制剂(SB203580)及牛磺酸对HIF-1α基因表达的影响。试图阐明烧伤后心肌细胞炎症/凋亡相关基因表达与心肌损伤的影响，阐明牛磺酸对烧伤后这些相关基因表达与释放的调控机制及其在相关的细胞信号转导途径的作用位点，深入研究牛磺酸保护烧伤后心肌细胞的作用机制方法： 新生乳鼠原代心肌细胞由胰酶消化法获得，本部分实验主要为： 1、建立缺氧复合烧伤血清心肌细胞损伤模型：实验分为常氧培养组、单纯缺氧组、缺氧复合烧伤血清组。观察本实验设计的缺氧复合烧伤血清培养心肌细胞在缺氧1h、3h、6h、12h、24h五个时间点心肌细胞损伤的情况：倒置相差显微镜下观测各组心肌细胞搏动的频率和节律，用ELISA法测定各时相细胞培养液心肌肌钙蛋白，并与单纯缺氧及常氧培养的细胞对比，以确立缺氧复合烧伤血清刺激心肌细胞的损伤程度，建立缺氧复合烧伤血清培养心肌细胞损伤模型。 2、研究相关基因的表达变化与心肌细胞损伤的关系及牛磺酸的影响：实验分组为：缺氧复合烧伤血清组、牛磺酸组、SB203580组、SB203580+牛磺酸组。对比观察p38激酶抑制剂SB203580、牛磺酸、牛磺酸+SB203580对缺氧复合烧伤血清培养的心肌细胞搏动频率和节律、细胞存活率(MTT法)等的影响；用RT-PCR检测HIF-1α、p38激酶、GRP94的mRNA水平，并用Western blot法半定量检测HIF-1α、p38激酶、磷酸化p38激酶水平，明确缺氧复合烧伤血清刺激心肌细胞时，这些基因的表达变化与心肌细胞损伤的关系及其牛磺酸的影响，同时观察心肌细胞HIF-1α、p38激酶表达与TNF—α、心肌肌钙蛋白的关系，试图探讨牛磺酸对炎症相关基因表达的具体作用环节。观察牛磺酸对GRP94表达的影响，初步探讨牛磺酸对烧伤后心肌细胞内质网应激相关基因的影响。 结果： 1、单纯缺氧培养1h心肌细胞搏动频率加快、强度增强；缺氧3h搏动频率减慢，节律较整齐；缺氧6h大多数细胞搏动浅慢，节律不整齐；缺氧12h绝大多数细胞已无搏动，极少数浅慢搏动，细胞贴壁较好；缺氧24h有较少的存活细胞，培养液心肌肌钙蛋白水平在缺氧3h以后即有显著性升高，提示心肌细胞出现损伤性改变。缺氧复合烧伤血清培养的心肌细胞缺氧1h、3h搏动频率与单纯缺氧类似；但缺氧6h细胞搏动频率及强度明显下降；缺氧12h绝大多数细胞无搏动，有少数细胞脱落，大多数细胞贴壁较差；缺氧24h无存活细胞；心肌肌钙蛋白水平缺氧3h后各时相点均比单纯缺氧组高，提示缺氧复合烧伤血清培养心肌细胞比单纯缺氧培养的心肌细胞损伤严重，即建立缺氧复合烧伤血清培养心肌细胞损伤模型。为便于研究出发，缺氧复合烧伤血清心肌细胞培养合适的缺氧时相为：1h、3h、6h、12h。 2、缺氧复合烧伤血清组HIF-1α、p38激酶、GRP94表达在缺氧早期(1h)即上调，缺氧3h明显增高，HIF-1α缺氧6h、12h为高峰；p38激酶6h达高值，12h表达量仍在高值；GRP94基因表达缺氧12h达高值，培养液肌钙蛋白水平、TNF-α水平与上述基因的表达呈正相关，提示这些基因在烧伤后心肌细胞应激起着一定的作用，持续高表达启动心肌炎症反应引起心肌的严重损伤。 3、牛磺酸组各时相心肌细胞搏动频率与缺氧复合血清培养心肌细胞相比较，除缺氧1h相似之外，其余时相心肌细胞搏动频率、强度均比单纯缺氧复合烧伤血清培养心肌细胞快和强度大，缺氧12h存活细胞明显增多，而培养液心肌肌钙蛋白水平、TNF-α则较后者低，HIF-1α、p38激酶蛋白水平降低，提示牛磺酸对心肌细胞保护作用与HIF-1α、p38激酶表达相关。 4、p38激酶抑制剂SB203580与单牛磺酸组在细胞搏动频率及培养液肌钙蛋白水平、TNF-α水平、HIF-1α、磷酸化p38激酶的蛋白水平无明显差异，而SB203580+牛磺酸组与上述两组有明显差别，提示牛磺酸有拮抗p38激酶活性，并且可能是影响HIF-1α的活性的原因。 5、半定量RT-PCR检测结果显示，牛磺酸组细胞较缺氧复合烧伤血清培养心肌细胞GRP94的表达量有显著性下降。提示牛磺酸下调烧伤后内质网应激相关基因的表达。 结论： 1、烧伤后的心肌细胞损伤不单纯是由于缺氧所致，烧伤早期血清存在着损伤心肌细胞的成分并且是烧伤后心肌细胞损伤的原因之一。 2、炎症损伤是心肌损伤的重要原因，心肌细胞的本身是炎症的策源地。 3、在体外缺氧复合烧伤血清培养的原代心肌细胞损伤模型上，证明了炎症因子释放相关的HIF-1α、P38激酶基因持续高表达是烧伤后心肌细胞损伤的因素。 4、初步证明了内质网应激相关基因GRP94表达参与了烧伤后心肌细胞的损伤过程，其持续高表达是烧伤后是心肌细胞损伤的因素。 5、牛磺酸可下调上述基因的表达，下调p38激酶的表达主要在翻译后水平，下调HIF-1α表达的机制可能是通过拮抗p38激酶活性，影响MAPK级联信号通路中p38途径。 第二部分：体内研究牛磺酸对内质网应激介导大鼠烧伤后心肌损伤相关基因表达的影响 目的:近年国内外学者重视内质网应激(ERS)的研究，但内质网应激参与心肌缺血/再灌注损伤的研究相对较少，特别是探讨内质网应激与烧伤后心肌细胞损伤的研究尚未见报道。烧伤后心肌细胞ERS特点，牛磺酸对严重烧伤后心肌细胞ERS有何影响尚未见报道。本实验探讨严重烧伤后心肌细胞的ERS特点、过度ERS与心肌细胞损伤的关系、观察心肌细胞损伤时内质网应激蛋白表达的改变及牛磺酸对其影响的分子机制，为牛磺酸在烧伤心肌损害防治中的应用提供了实验依据。 方法: 1.建立大鼠30％TBSAⅢ度烫(烧)伤动物模型。 2.HE染色普通光学显微镜观察烧伤后及牛磺酸治疗后心肌组织形态变化。 3.用放射免疫和酶联免疫法观测烧伤大鼠在伤后血浆和心肌中cTnT、TNFα含量的变化及牛磺酸的影响。 4.用免疫组织化学方法分析大鼠心肌NF-KB、MAPKp38蛋白表达情况。 5.RT-PCR测定GRP94、caspase-12基因的表达变化。 结果: 1.通过HE染色观察发现烧伤后心肌组织严重损伤，经牛磺酸治疗后损伤减轻。 2.放射免疫和酶联免疫法观测发现烧伤后血浆和心肌中cTnT、TNFα含量上升，牛磺酸治疗后两指标含量下降。 3.免疫组化分析表明：烧伤后NF-KB、MAPKp38迅速增加，伤后6h达峰值，伤后24h仍高于对照组。牛磺酸治疗组心肌NF-κB，MAPKp38水平较烧伤组有显著性降低。 4.半定量RT-PCR检测结果显示，烧伤1h后GRP94、Caspase-12的较对照组有所升高，12h后达高峰，而牛磺酸治疗组两基因的表达量较烧伤组有显著性下降。 结论: 1.严重烧伤后心肌GRP94和Caspase-12表达明显升高，表明严重烧伤后心肌存在内质网应激反应，且内质网应激参与了烧伤后心肌损伤。 2.牛磺酸对严重烧伤后内质网应激介导的心肌损伤具有较好的保护作用，其分子机制主要是通过下调GRP94及内质网相关性死亡途径中Caspase-12的表达及其活性等。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩写词对照表

声明

前言

第一章体外研究 牛磺酸对心肌细胞损伤相关基因表达的影响

第一节缺氧复合烧伤血清心肌细胞损伤模型的建立

1、前言

2、材料

3、方法

4、结果

5、结论

6、讨论

第二节牛磺酸对心肌细胞损伤相关基因HIF-1α、P38激酶、GRP94表达的影响

1、前言

2、材料

3、方法

4、结果

5、结论

6、讨论

第二章：体内研究 牛磺酸对内质网应激介导烧伤后大鼠心肌损伤相关基因表达调控的影响

1、前言

2、材料与方法

3、结果

4、结论

5、讨论

第三章全文总结

致谢

参考文献

综述 严重烧伤后心肌损伤的细胞分子生物学机制

攻读学位期间的成果