同步分离纯化荷叶黄酮、生物碱和多糖工艺的研究及荷叶生物碱的功能研究

摘要

近年来，荷叶作为新资源植物，正被人们广泛地研究利用。荷叶中含有大量对人体有益的活性物质，包括生物碱、黄酮类化合物、活性多糖等。本工作建立了同步分离提取、纯化此三种活性成分的工艺方法，并对荷叶提取物与DNA和BSA相互作用方式进行了初步探索。 研究发现，从荷叶干粉中提取荷叶黄酮的工艺参数为：pH=13；乙醇浓度为50％；固液比为：1:30；提取温度为75℃；提取时间为2小时；提取次数为1次。从提取黄酮后的荷叶残渣中提取荷叶生物碱的工艺参数为：pH=2.0；乙醇浓度为90％：固液比为：1:25；提取温度为85℃；提取时间为2小时：提取次数为2次。从提取黄酮及生物碱后的荷叶残渣中用水提取荷叶多糖的工艺参数为：pH=7；固液比为：1:30：提取温度为75℃；提取时间为2小时；提取次数为1次。经AB-8大孔树脂纯化荷叶黄酮后，得到棕黄色粉末，纯度为84.43％，得率为90％。经D101大孔树脂纯化荷叶生物碱后，得到黄绿色粉末，纯度为82.76％，得率为90.21％。经脱蛋白和脱色处理荷叶多糖后，得到略带黄色的白色粉末，纯度为85.74％，得率为85.81％。此研究为对充分利用我国的天然植物资源--荷叶、并作为保健食品的开发利用提供了科学数据，具有重要的应用价值。 建立了在中性色谱条件下采用反相高效液相色谱准确测定荷叶生物碱组成成分的方法，并结合质谱分析，测定了荷叶生物碱提取物中五种主要的生物碱成分的分子量，分别为MA265，MB311，MC281，MD295，ME311，推测依次为番荔枝碱(Anonaine)，原荷叶碱(Pronuciferine)，N-去甲基荷叶碱(N-Nornuciferine)，荷叶碱(nuciferine)和亚美罂粟碱(Armepavine)。 在选定的两相溶剂体系下，采用HSCCC法，研究得到分离纯化最优工艺条件：温度31℃，螺旋管转速850rpm，流速1.8mL/min。成功地对荷叶生物碱进行了分离纯化，得到的五个组分，经HPLC检测，纯度分别为：番荔枝碱99.6％；原荷叶碱)91.2％；N-去甲基荷叶碱98.5％；荷叶碱99.3％；亚美罂粟碱96.1％。 探索了荷叶生物碱提取物及荷叶碱与DNA及BSA的作用方式，研究结果表明，在生理条件下(pH=7.4)，DNA对荷叶碱及荷叶生物碱提取物的荧光猝灭属于形成了新的复合物的静态荧光猝灭，荷叶碱及荷叶生物碱提取物与DNA作用方式均为混合方式，即嵌插与沟槽作用是两种主要作用方式，测得其结合常数分别为1.396×106L/mol，3.765×106L/mol。在生理条件下(pH=7.4)，两种供试物都能与BSA形成复合物，从而引起了对BSA荧光的静态猝灭。测得其结合常数分别为5.194×106L/g，1.127×105L/g。为深入研究生物碱类化合物的药物开发和新药筛选提供了一定的理论依据，

目录

文摘

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论文说明：缩略词

声明

第一章绪论

1.1引言

1.2荷叶中生理活性成分研究概况

1.2.1黄酮、生物碱及挥发性精油

1.2.2有机酸类及鬼臼毒素

1.2.3多糖

1.2.4其他化学成分

1.3荷叶中活性成分的分离纯化及分析方法

1.3.1黄酮分离纯化及分析方法

1.3.2生物碱分离纯化及分析方法

1.3.3多糖分离纯化及分析方法

1.4荷叶中活性成分的生理功能及应用研究

1.4.1荷叶黄酮及生物碱提取物生理功能及应用研究

1.4.2多糖的生理功能及应用研究

1.5黄酮及生物碱对DNA和BSA的互相作用研究

1.5.1药物与DNA相互作用研究进展

1.5.2药物与血清蛋白相互作用研究进展

1.6本课题研究的目的、意义及主要内容

1.6.1课题来源

1.6.2研究价值与意义

1.6.3主要研究内容

第二章荷叶黄酮、生物碱、多糖同步分离提取与纯化

2.1引言

2.2试验材料与仪器

2.2.1材料

2.2.2试剂

2.2.3仪器及设备

2.3试验方法

2.3.1同步分离提取荷叶三种活性成分的工艺研究

2.3.2标准曲线的制备

2.3.3原材料中黄酮、生物碱、多糖含量的测定

2.3.4荷叶黄酮、生物碱、多糖的提取的单因素试验

2.3.5荷叶黄酮、生物碱、多糖提取的正交试验

2.3.6荷叶黄酮、生物碱、多糖提取的批量试验

2.3.7荷叶黄酮、生物碱、多糖粗提物的紫外扫描吸收光谱

2.3.8荷叶黄酮的纯化

2.3.9荷叶生物碱的纯化

2.3.10荷叶多糖的脱色及除蛋白工艺

2.4结果与分析

2.4.1原料中荷叶黄酮、生物碱、多糖含量的测定

2.4.2荷叶黄酮、生物碱、多糖的提取试验

2.4.3荷叶黄酮、生物碱、多糖提取的正交试验

2.4.4荷叶黄酮、生物碱、多糖提取的批量试验

2.4.5荷叶黄酮、生物碱、多糖粗提物的紫外扫描吸收光谱

2.4.6荷叶黄酮的纯化

2.4.7荷叶生物碱的纯化

2.4.8荷叶多糖的脱色及除蛋白工艺

2.5讨论

2.5.1提取因素对荷叶黄酮、生物碱同步分离提取的影响

2.5.2纯化工艺对荷叶黄酮、生物碱纯化的影响

2.5.3荷叶多糖的纯化

2.5.4同步提取荷叶黄酮、生物碱和多糖工艺的优越性

2.6小结

第三章 HPLC-MS法测定荷叶生物碱提取物的组成成分

3.1引言

3.2材料与仪器

3.2.1材料及试剂

3.2.2仪器及设备

3.3试验方法

3.3.1样品的制备

3.3.2 HPLC检测波长的选择

3.3.3工作曲线的绘制

3.3.4碱性条件下的色谱分析

3.3.5中性条件下的色谱分析

3.3.6方法学考察

3.3.7质谱条件

3.4结果与分析

3.4.1 HPLC检测波长选择结果与分析

3.4.2工作曲线的绘制

3.4.3碱性条件下荷叶生物碱提取物的HPLC色谱图

3.4.4中性条件下荷叶生物碱提取物的HPLC色谱图

3.4.5由HPLC所确定的五种主要成分的紫外扫描特征吸收谱图

3.4.6方法学考察

3.4.7质谱模式的选择

3.4.8生物碱的定性鉴定

3.5讨论

3.5.1 对两种色谱条件的分析

3.5.2对生物碱质图谱的分析

3.6本章小结

第四章高速逆流色谱分离纯化荷叶生物碱提取物中五种生物碱

4.1引言

4.2材料与仪器

4.2.1材料及试剂

4.2.2仪器及设备

4.3试验方法

4.3.1样品的制备

4.3.2溶剂体系的选择

4.3.3HSCCC操作条件的优化

4.3.4 HSCCC分离的过程

4.3.5 HPLC分析条件

4.4结果与分析

4.4.1 溶剂体系选择

4.4.2 HSCCC操作条件的优化

4.4.3 HSCCC分离的效果

4.4.4 HPLC操作条件优化及产品纯度测定

4.5 讨论

4.5.1溶剂体系的选择对荷叶生物碱分离效果的影响

4.5.2 HSCCC操作条件优化的分析

4.6本章小结

第五章 荷叶生物碱提取物和荷叶碱与DNA和BSA相互作用的研究

5.1引言

5.2材料与仪器

5.2.1材料及试剂

5.2.2仪器及设备

5.3试验方法

5.3.1 DNA对NUC和ALKE紫外吸收光谱的影响

5.3.2 DNA对NUC和ALKE的荧光光谱的影响

5.3.3盐效应

5.3.4阴离子效应

5.3.5 NUC和ALKE对NR-DNA的同步荧光光谱的影响

5.3.6 NUC和ALKE与牛血清蛋白(BSA)的相互作用

5.4结果与分析

5.4.1 DNA对NUC和ALKE的紫外吸收光谱的影响

5.4.2 DNA对NUC和ALKE的荧光光谱的影响

5.4.3盐效应

5.4.4阴离子效应

5.4.5 NUC和ALKE对NR-DNA的同步荧光光谱的影响

5.4.6 NUC和ALKE与牛血清蛋白(BSA)作用的研究

5.5讨论

5.5.1 NUC和ALKE对DNA相互作用的机理

5.5.2 NUC和ALKE与牛血清蛋白(BSA)相互作用的机理

5.6本章小结

第六章结论

参考文献

致 谢

攻读硕士学位期间的科研成果