鲫鱼PKR-like(PKZ)Zα结构域与d(GC)、d(TA)重组质粒的亲和性

摘要

Zα是能够识别并特异性结合左旋DNA(Z-DNA)的蛋白结构域。鲫鱼PKR-like(PKZ)是首次报道的具有Zα结构域的鱼类蛋白激酶。为深入了解鲫鱼PKR-like(PKZ)Zα的功能，本研究构建替换型Pzα1Zα1的cDNA，并运用PCR定点突变方法构建点突变型(PZαK34A、PZαS35A、PZαR39A、PZαP57A)的cDNA，然后与表达载体连接，转化表达菌BL21(DE3)pLysS并诱导表达。同时，诱导表达野生型PZα1Zα2。镍柱亲和层析纯化获得突变型融合多肽。 另一方面，以pMD18-T质粒为母本质粒，将含有(GC)6、d(GC)13、d(TA)13片段的特殊序列插入到pMD18-T质粒中。甲基化抑制实验证实重组质粒中的插入序列d(GC)6、d(GC)13为“潜在”的Z-DNA。另外，还构建了发夹结构的核酸(d(GC)3T4d(GC)3、d(GC)6Tad(GC)6)和寡聚核苷酸(d(GC)6、d(GC)13)。 凝胶阻滞试验分析3种多肽，即野生型PZα1Zα2、替换型PZα1Zα1和4个点突变型(PZαK34A、PZαS35A、PZαR39A、PZαP57A)，分别与重组质粒的亲和性。结果显示：野生型PZα(Zα1Zα2)和替换型P(Zα1)2(Zα1Zα1)能够对3种重组质粒的迁移产生明显的阻滞效应，并且随着多肽浓度的增大，阻滞效应越明显。与野生型PZα(Zα1Zα2)相比，替换型P(Zα1)2(Zα1Zα1)结合重组质粒的能力更强。4种突变体都不能与3种重组质粒结合，暗示鲫鱼PKR-likeZα结构域这4个氨基酸残基在结合核酸分子的过程中非常关键。 凝胶阻滞实验还分析了野生型PZα1Zα2和替换型PZα1Zα1分别与发夹结构的核酸、寡聚核苷酸的亲和性，结果显示：野生型PZα1Zα2和替换型PZα1Zα1能够与其发生微弱的结合，但其结合能力差异不明显。

目录

文摘

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声明

第一章文献综述

1.1 eIF2α激酶家族

1.1.1 eIF2α激酶结构特征

1.1.2 eIF2α激酶作用机制

1.2鱼类eIF2α激酶与PKZ

1.3 Zα研究进展

1.3.1 Zα的功能

1.3.2 Zα结构特征

1.4 本研究的目的与意义

第二章材料与方法

2.1主要仪器设备

2.2主要试剂、试剂盒

2.3质粒和菌株

2.4相关软件

2.5替换型PZα1Zα1 cDNA的构建

2.5.1目的基因片段的克隆

2.5.2目的基因片段的连接与鉴定

2.6 PZα定点突变

2.6.1引物设计

2.6.2质粒模板处理

2.6.3 PCR扩增突变产物

2.6.4测序鉴定

2.7原核表达

2.8表达产物的纯化(PZα)

2.9 PZα蛋白质浓度的测定

2.9.1标准曲线的绘制

2.9.2样品的测定

2.10 d(GC)6、d(GC)13和d(TA)13重组质粒的构建

2.11发夹结构核酸与寡聚核酸的构建

2.12甲基化抑制试验

2.12.1含d(GC)6、d(GC)13片段DNA的制备

2.12.2甲基化抑制试验

2.13凝胶阻滞实验

2.13.1 PZα与重组质粒d(GC)6、d(GC)13和d(TA)13的结合

2.13.2不同浓度PZα与重组质粒d(GC)6、d(GC)13和d(TA)13的结合

2.13.3 PZα与发夹结构和寡聚核酸的结合

第三章结果与分析

3.1 PZαlZαl cDNA的构建

3.2 PCR法定点突变

3.3原核表达及纯化

3.3.1 PZα cDNA的原核表达

3.3.2 PZα的纯化

3.4 PZα浓度的测定

3.5 d(GC)6、d(GC)13、d(TA)13重组质粒的构建

3.6甲基化抑制试验

3.6.1含d(GC)6、d(GC)13片段DNA的克隆

3.6.2甲基化抑制实验

3.7 PZα与核酸分子的结合

3.7.1 PZα与重组质粒d(GC)6、d(GC)13和d(TA)13的结合

3.7.2不同浓度PZα与d(GC)6、d(GC)13和d(TA)13重组质粒结合

3.7.3 PZα与发夹结构核酸和寡聚核酸的结合

第四章讨论

4.1 d(GC)n等核酸分子可以形成Z-DNA

4.2 ZαPKR-like与d(GC)n等核酸分子的结合

4.3 Zα与核酸的结合的分子机理

4.2.1 Zα与核酸结合模型

4.2.2 Zα与核酸相互作用的保守位点

第五章小结

参考文献

致谢

附录1：缩略语