拟南芥RPL36B基因在酿酒酵母中有效剪接所需要的顺式作用元件

摘要

mRNA前体的剪接或者内含子的剪切需要通过剪接机器精确的识别内含子序列。拟南芥RPL36B基因内含子在酵母中不能有效地剪切。为了了解其机制，将拟南芥RPL36B基因第一个内含子的剪切位点和分支位点进行突变和替换。并转入内源RPL36B缺失酿酒酵母中，观察其生长状况并检测内含子的剪切效率，从中找出重要的顺式作用元件。发现酵母RPL3685’剪切位点突变和分支位点TACTAAC插入在酵母中能促进拟南芥的有效剪切，而替换为酵母内含子的拟南芥RPL36B在SC-His+5FOA培养基中剪切效率有所下降。

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第1章 前言

1.1 Pre-RNA剪接反应机制概述

1.2剪接体组装中的内含子和外显子的界定

1.3剪接体的组装过程

1.4酿酒酵母和拟南芥的剪接顺式作用元件保守序列的比较

1.5 mRNA前体剪接因子

1.5.1 SR蛋白

1.5.2 hnRNP形成因子

1.5.3 RNA解旋酶类剪接因子

1.6内含子在基因表达过程中的作用

1.6.1内含子在基因表达调控中的正调控作用

1.6.2选择性的保留内含子在基因表达调控中的作用

1.6.3第一个内含子在基因表达调控中的作用

第2章 材料与方法

2.1实验材料

2.1.1质粒

2.1.2菌种

2.1.3植物材料

2.1.4酶及化学试剂

2.1.5主要仪器设备

2.1.6培养基及试剂配制

2.2实验方法

2.2.1生物信息学分析

2.2.2不同克隆的构建策略

2.2.3酵母电转化

2.2.4酵母化学转化

2.2.5 plasmid shuffling

2.2.6在体外构建RPL36基因点突变

2.2.7酵母总RNA抽提

2.2.8 RT-PCR

2.2.9 RNA变性电泳

2.2.10 PCR扩增拟南芥RPL36B不同克隆的所需片段引物

2.2.11 pBluescript Ⅱ SK(-)多克隆位点及质粒图谱

2.2.12 Touchdown PCR反应体系

2.2.13PCR产物的检测

2.2.14PCR产物纯化回收

2.2.15拟南芥RPL36B目的片段在SK(-)载体的克隆

2.2.16大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化

2.2.17菌落PCR验证转化结果

2.2.18大肠杆菌质粒抽提及酶切验证

2.2.19拟南芥RPL36B构建与表达载体prs413的连接

第3章 实验内容和结果

3.1内含子2级结构的分析

3.2实验内容

3.2.1拟南芥启动子替换成酵母RPL36B启动子

3.2.2拟南芥RPL36B基因3’剪切位点替换

3.2.3酵母分支位点插入拟南芥第一个内含子

3.2.4拟南芥RPL36B第一个内含子替换成酵母RPL36B内含子

3.2.5拟南芥RPL36B cDNA的构建

3.2.6各种构建生长表达的比较

3.3拟南芥RPL36B在酿酒酵母中的表达

3.4含第一个内含子的拟南芥cDNA以及5’剪接位点突变和酵母内含子替换拟南芥内含子的拟南芥cDNA在酵母中的剪接差异

3.5拟南芥RPL36B的cDNA和酿酒酵母RPL36B的cDNA和含有酵母第一个内含子的LacZ报告基因以及酵母RPL36B外源基因的再次转入

3.6将拟南芥内含子趋向酵母内含子剪接位点保守区域的突变和替换，并观察其剪接效率

第4章 讨论

致谢

参考文献

附录