缝隙连接在一氧化氮缓解脑血管痉挛中作用的研究

摘要

目的： 蛛网膜下腔出血（SAH）后脑血管内外舒张因子一氧化氮（NO）减少是诱发脑血管痉挛（cvs）的最重要因素之一。同样缝隙连接（GJ）在许多心脑血管疾病的发生和发展中扮演着重要角色。本实验在前期研究的基础上，拟研究缝隙连接在NO缓解脑血管痉挛中的作用及缝隙连接蛋白表达的变化，为更深入研究脑血管GJ通道参与蛛网膜下腔出血（SAH）后CVS的机制奠定基础，为临床防治cvs提供更好的理论依据。 方法： 1.体外游离脑血管环张力实验：各实验组动物处死后断头取脑，分离基底动脉，将其剪成3-4mm的动脉环。用不同浓度的前列腺素F2a（PGF2a）、不同浓度的NO供体DETA-NO、不同浓度的GJ阻断剂甘珀酸、可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）抑制剂1 H-[1，2，4]恶二唑[4，3，-a]喹喔啉-1-酮（ODQ）等药物孵育，应用生物信息转换记录仪记录血管张力的变化。 2.体外脑血管条孵育：各实验组动物被处死后立即断头取脑，显微镜下分离基底动脉，将其剪成完整的动脉条；用不同浓度的PGF2a、不同浓度的DETA-NO、GJ阻断剂甘珀酸、sGC抑制剂ODQ等药物孵育动脉条；Western Blotting检测兔基底动脉条缝隙连接蛋白43（Cx43）蛋白表达的变化。 3.兔体内CVS模型的建立及药物处理：采用同种系兔。静脉麻醉动物后，行小脑延髓池穿刺，注入自体非抗凝血以建立体内SAH模型。NO供体DETA-NO、sGC抑制剂ODQ均经鞘内注入小脑延髓池。采用选择性的脑血管造影技术测量BA直径变化：Western blotting检测兔基底动脉Cx43蛋白表达的变化。 结果： 1.0.3-30μmol/L的PGF2a能明显诱导游离脑血管环收缩，并呈浓度依赖性地增加血管环张力，10μmol/L的PGF2a即能明显地诱导体外脑血管环收缩；用DETA-NO处理后能明显缓解PGF2a诱导的体外脑血管环的张力，0.3-100μmol/L的DETA-NO呈浓度依赖性地缓解血管环的收缩；用ODQ干预后能有效地减弱DETA-NO缓解PGF2a诱导的脑血管环的收缩；GJ阻断剂甘珀酸处理和预处理后均能有效地缓解PGF2a诱导的体外血管环收缩，不同浓度的甘珀酸呈浓度依赖性地缓解PGF2a诱导的体外脑血管环的收缩。 2.0.3-30μmol/L的PGF2a能使体外基底动脉中Cx43蛋白的表达呈浓度依赖性地上调；DETA-NO处理后能有效地抑制PGF2a诱导的Cx43蛋白表达上调，DETA-NO在0.3-100μmol/L范围内呈浓度依赖性地抑制PGF2a诱导的Cx43蛋白表达上调，而300μmol/L的DETA-NO却不能有效地下调Cx43蛋白的表达；用ODQ干预后能有效地抑制DETA-NO下调Cx43蛋白的表达；GJ阻断剂可明显抑制PGF2a诱导Cx43蛋白表达的增加。 3.脑血管造影显示DETA-NO能明显缓解CVS，用sGC抑制剂ODQ干预后可抑制DETA-NO缓解CVS的作用。SAH后Day7基底动脉中Cx43蛋白表达较正常组明显上调；SAH后Day7注入DETA-NO后基底动脉中Cx43蛋白表达较SAH组蛋白表达明显下调：sGC抑制剂ODQ干预后可有效地抑制DETA-NO下调Cx43蛋白的表达。 结论： 1.缝隙连接参与了PGF2a诱导的脑血管收缩过程。PGF2a呈浓度依赖性地诱导离体基底动脉收缩，并呈浓度依赖性地使离体脑血管中Cx43蛋白表达上调；GJ抑制剂甘珀酸能有效地抑制PGF2a诱导的脑血管收缩，并可使PGF2a收缩脑血管中Cx43蛋白的表达下调。 2.缝隙连接很可能参与了NO缓解脑血管痉挛的过程。NO能有效地下调脑血管壁细胞中Cx43蛋白的表达，并有效地缓解SAH后的CVS和PGF2a诱导的脑血管收缩。NO缓解脑血管收缩和下调脑血管中Cx43蛋白表达的分子机制可能（至少部分）是通过NO-cGMP途径发挥作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第1章引 言

第2章材料与仪器

2.1实验动物

2.2实验试剂

2.2.1主要购置试剂

2.2.2主要配制试剂

2.3实验仪器

第3章方法

3.1实验思路

3.1.1体外游离脑血管环张力实验

3.1.2体外脑血管条实验组药物孵育

3.1.3兔体内CVS模型的建立及实验组药物处理

3.2体内实验

3.2.1实验分组

3.2.2兔体内CVS模型的建立

3.2.3选择性脑基底动脉造影及血管直径的测量

3.3 Western blotting技术检测Cx43蛋白表达的变化

3.3.1总蛋白样品制备

3.3.2样品蛋白含量的测定

3.3.3配制5％积层胶及8％分离胶

3.3.4灌胶及上样

3.3.5垂直电泳

3.3.6转膜

3.3.7目标蛋白免疫反应

3.3.8目标蛋白化学发光及曝光

3.3.9膜再生

3.3.10内参蛋白免疫反应

3.3.11内参蛋白化学发光及曝光

3.3.12图像分析

3.4体外游离脑血管环张力实验

3.4.1实验分组及实验步骤

3.4.2实验系统连接和仪器参数设置

3.4.3兔基底动脉环的制备

3.5体外脑血管条孵育实验

3.5.1实验分组及步骤

3.5.2兔体外基底动脉条的制备

3.6数据统计分析

第4章结果

4.1体内实验

4.1.2CVS后各组Cx43蛋白表达的变化

4.2体外游离脑血管环张力实验(结果见附图)

4.2.1 PGF2a诱导的血管环张力变化

4.2.2 PGF2a+DETA-NO诱导的血管环张力变化

4.2.3PGF2a+ODQ诱导的血管环张力变化

4.2.4 PGF2a+ODQ+DETA-NO诱导的BA环张力变化

4.2.5PGF2a+DMSO诱导的血管环张力变化

4.2.6 PGF2a+CBX诱导的血管环张力变化

4.3体外脑血管条孵育实验

第5章讨论

5.1蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管痉挛(CVS)

5.2 CVS研究仍存在的问题

5.3 NO的生物特性及SAH后脑血管中NO的化

5.3.1 NO的生物特性

5.3.2 SAH后脑血管中NO的变化

5.4缝隙连接(gap junction GJ)

5.4.1细胞GJ的功能及调节

5.4.2缝隙连接蛋白43(Cx43)

5.4.3 NO对Cx43及GJ功能调节的研究

5.5展望

第6章结论

致谢

参考文献

附图

综述蛛网膜下出血后一氧化氮的变化及相关治疗

攻读学位期间的研究成果