幽门螺杆菌对CD4 CD25调节性T细胞的影响及意义的研究

摘要

背景和目的： 幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）逃逸宿主的免疫清除，长期定植在胃黏膜引起慢性持续性感染的机制目前尚不清楚。调节性T细胞（Regulatory T Cells，Treg）是一类具有免疫调节功能的T细胞群体，主要发挥免疫抑制作用，在多种免疫性疾病中起重要作用。近年来研究表明Treg在H.pylori逃逸宿主免疫清除及调节H.pylori感染所致炎症反应中起一定作用。为此本研究在体内外观察了H.pylori对CD4+CD25+Foxp3+Treg的影响，以期从CD4+CD25+Treg的角度探讨H.pylori致病机制，为后续以CD4+CD25+Treg为靶点防治H.pylori感染和H.pylori相关性疾病提供理论和实验依据。 方法： （1）患者及标本：239例胃镜活检的胃黏膜，其中非萎缩性胃炎（CNAG）75例（H.pylori阳性50例，H.pylori阴性25例），萎缩性胃炎（CAG）24例（H.pylori阳性13例，H.pylori阴性11例），肠化与异型增生（IM+DYS）90例（H.pylori阳性45例，H.pylori阴性45例），胃癌50例（H.pylori阳性15例，H.pylori阴性35例）。 （2）小鼠H.pylori感染模型建立和根除治疗：6-8周龄的清洁级的BALB/c小鼠，给予含1.0×109/ml的SS1H.pylori活菌液，0.5ml/只，灌胃，隔日一次，共5次。建立动物模型后，随机分为4组：①感染组：仅给予药物赋形剂5％阿拉伯树胶溶液；②治疗组1：阿莫西林（AM）+5％阿拉伯树胶溶液；③治疗组2：AM+奥美拉唑（OM）+5％阿拉伯树胶溶液；④治疗组3：AM+OM+壳聚糖+5％阿拉伯树胶溶液，每组10只；分别给予上述药物每日2次灌胃，共2周。另设一正常对照组不给予H.pylori和任何药物。停药后4周，处死小鼠，取标本待测。 （3）H.pylori与小鼠脾淋巴细胞共培养：以不同浓度的SS1H.pylori活菌（0CFU/ml、0.50×107CFU/ml、1.00×107CFU/ml、2.00×107CFU/ml、4.00×107CFU/ml）与原代分离的BALB/c小鼠脾淋巴细胞共培养，分别在3h、6h、12h和24h点收集细胞。 （4）各项指标检测：①胃黏膜内H.pylori的检测：采用改良Giemsa染色和H.pylori定量培养法检测；②血清抗H.pyloriCagA-IgG检测：采用间接ELISA法；③小鼠淋巴细胞和胃黏膜内Foxp3mRNA检测：采用RT-PCR方法检测；④胃黏膜内Foxp3蛋白的检测：采用二步法免疫组织化学染色法检测；⑤CD4+CD25+Treg检测：采用流式细胞术检测。 研究结果： （1）H.pylori感染和根除对胃黏膜内Foxp3表达的影响； ①在各疾病组患者，H.pylori阳性患者胃黏膜内Foxp3表达显著高于H。pylori阴性者（P<0.001，0.01），胃癌组Foxp3的表达显著高于CNAG、CAG和IM+DYS组患者（P<0.001，0.005）；CagA阳性和阴性H.pylori菌株感染者胃黏膜内Foxp3阳性细胞百分比无显著差异（P>0.05）。 ②在小鼠H.pylori感染模型中，H.pylori感染小鼠胃黏膜内Foxp3mRNA表达和其阳性细胞百分比均显著高于正常未感染小鼠（P<0.001）；而H.pylori根除后小鼠胃黏膜内Foxp3mRNA表达和其阳性细胞百分比显著下降，显著低于H.pylori感染小鼠和H.pylori未根除小鼠（P<0.001），与正常小鼠无差异（P>0.05），同一治疗组中H.pylori根除小鼠胃黏膜内Foxp3mRNA表达和其阳性细胞百分比均显著低于与未根除小鼠（P<0.001）。 （2）H.pylori对小鼠脾淋巴细胞CD4+CD25+Treg的影响： ①H.pylori活菌作用小鼠淋巴细胞3h、6h和12h后对小鼠淋巴细胞内Foxp3mRNA的表达无显著影响（P>0.05）；在24h时不同浓度的H.pylori活菌作用小鼠淋巴细胞可显著降低其Foxp3mRNA的表达，并呈浓度依赖性（P<0.001），随着H.pylori活菌浓度增加，Foxp3mRNA的表达逐渐降低，各浓度组均显著低于对照组（P<0.001，0.05），2.00×107CFU/ml组显著低0.50×107CFU/ml组（P<0.05）；4.00×107CFU/ml组显著低于其他各浓度组（P<0.001）。 ②流式细胞仪检测表明，H.pylori活菌作用小鼠淋巴细胞6h和12h后CD4+CD25+Treg细胞百分比无显著变化（P>0.05）；在24h时，不同浓度的H.pylori活菌作用小鼠淋巴细胞可显著降低CD4+CD25+Treg细胞百分比，并呈浓度依赖性（P<0.05），随着H.pylori活菌浓度增加，CD4+CD25+Treg细胞百分比下降，4.00×107CFU/ml浓度组显著低于对照组（P<0.01）、0.50×107CFU/ml浓度组（P<0.05）和1.00×107CFU/ml浓度组（P<0.01）。 结论： （1）H.pylori定植于胃黏膜可显著增加胃黏膜内Foxp3+Treg的数量，从而有利于其逃避宿主免疫清除，这可能是H.pylori在体内形成慢性持续感染的重要原因。 （2）无论是H.pylori阴性还是阳性的胃癌患者，其胃黏膜内Foxp3阳性细胞数显著增加，提示在胃癌患者存在免疫抑制现象。 （3）H.pylori根除小鼠胃黏膜内CD4+CD25+Foxp3+Treg显著减少，它的减少是继发于H.pylori根除后，还是小鼠胃黏膜局部的CD4+CD25+Foxp3+Treg少从而有利于H.pylori的根除，这有待进一步研究。 （4）H.pylori菌在体外可下调小鼠淋巴细胞Foxp3mRNA的表达及减少CD4+CD25+Treg数量，提示H.pylori菌直接与淋巴细胞作用，可抑制淋巴细胞分化为Treg，这与其在体内的作用不同，这可能是H.pylori自然感染和H.pylori疫苗接种后诱导不同免疫反应的机制之一。

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文摘

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第一章 引言

第二章 H.pylori感染和根除对胃黏膜内Foxp3表达的影响

2.1材料与方法

2.1.1 H.pylor感染及其相关性疾病患者胃黏膜内Foxp3的表达

2.1.2小鼠H.pylori感染和根除后胃黏膜内Foxp3的表达

2.1.3统计学处理

2.2结果

2.2.1 H.pylori感染及其相关性疾病患者胃黏膜内Foxp3的表达

2.2.2小鼠H.pylori感染和根除后胃黏膜内Foxp3的表达

2.3讨论

2.4结论

第三章 H.pylori对小鼠脾淋巴细胞CD4+CD25+Treg的影响

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.1.3统计学处理

3.2结果

3.2.1 H.pylori活菌对小鼠淋巴细胞内Foxp3 mRNA表达的影响

3.2.2 H.pylori活菌作用后小鼠淋巴细胞中CD4+CD25+Treg变化

3.3讨论

3.4结论

致谢

参考文献

附录综述 调节性T细胞与幽门螺杆菌感染

攻读学位期间的研究成果