新型多肽神经组织工程支架材料及神经干细胞在其表面生长分化的实验研究

摘要

目的：（1）建立小鼠乳鼠大脑皮质神经干细胞的分离、培养方法。 （2）鉴定神经干细胞及分化后的细胞，为神经干细胞的体内移植研究奠定基础。 方法：体外分离出新生SD小鼠（出生1-3天内）的大脑皮质，机械吹打，采用无血清悬浮培养法，采用DMEM/F12培养基，添加B27，bFGF和EGF等生长因子，调整细胞密度至1×107/L，1×108/L，1×109/L，1×1010/L进行体外培养，倒置相差显微镜观察细胞形态，取得具有自我复制、增殖能力的细胞，并将细胞贴壁培养检测其分化能力，应用多克隆兔抗鼠巢蛋白（Nestin）、多克隆兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶（Neuron Specific Enolase NSE）、多克隆兔抗鼠胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体，免疫组化鉴定细胞。 结果： （1）从新生小鼠大脑皮层组织分离出的细胞，在添加B27和EGF、bFGF的DMEM/F12的无血清培养基中，可持续增殖，聚集成神经球。细胞经过贴壁后分化为神经元及神经胶质细胞，此法较简单，为进行NSCs体内移植奠定了基础。 （2）MTT实验显示按1×109/L密度培养细胞增殖最快，细胞数量从第3天起迅速增殖，于第7天达高峰。 （3）免疫细胞化学法呈现：抗Nestin阳性、抗NSE阳性，抗GFAP阳性。 结论：按上述方法分离、培养出的细胞具有自我复制、增殖及分化为神经元和胶质细胞的特性，属于神经干细胞（NSCs）。 目的：设计合成含IKVAV的新型组织工程多肽序列，研究其在不同条件下自组装为多孔凝胶及生物力学特性。 方法：用传统的固相法合成多肽（上海波泰生物科技有限公司），使用高效液相色谱仪（High performance liquid chromatograph，HPLC）测定纯度，质谱仪（Mass spectrometer，MS）测定分子量；将合成的多肽粉末溶于0.1mol/LNaOH溶液中，配成10，2，1，0.5％wt肽溶液，各取200ul肽溶液，加入等体积的DMEM/F12，涂于盖玻片或置于10mol/L盐酸蒸汽中，置入37℃干燥箱。使用扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）及透射电镜（transmission electron microscope，TEM）检测自组装凝胶的结构，凝胶的流变学特性则使用血流计来测定。 结果：MS示肽的分子量为1351.72，HPLC示其纯度为95％。多肽在DMEM/F12触发下，数秒内形成凝胶；于10mol/L HCL蒸气中，2小时后形成凝胶薄膜；在37℃恒温干燥箱中，仅见白色肽粉末，未见凝胶；SEM检测10％wt多肽自组装凝胶由许多纳米纤维构成，呈现多孔厚壁结构，TEM示：2，1，0.5％wt多肽自组装凝胶是由相互交叉的编织状纳米纤维构成。1％wt多肽凝胶纤维直径有3.5～5nm，长度95nm～1500nm；2％wt多肽凝胶纳米纤维十分密集；0.5％wt肽凝胶纳米纤维十分细，纤维间有较大的空隙；时间扫描流变学示：损耗模量呈线性比存储模量小，证实自组装凝胶有一定生物力学强度，可支撑接种的细胞。 结论：本实验设计合成了新型组织工程多肽，在DMEM/F12中可自组装成多孔凝胶，成功合成了一种含IKVAV等活性区域的新型脊髓组织工程支架材料。 目的：体外分离培养出NSCS，接种于组织工程多肽自组装多孔凝胶的表面，观察NSCS在二维凝胶表面及其血清，联合因子等条件下生长、分化情况。 方法：取小鼠乳鼠的大脑皮质，机械分离，无血清悬浮培养出NSCS，用免疫细胞化学法，链霉亲和素-生物素-过氧化物酶（Streptavidin biotin peroxidase Complex，SABC）检测试剂盒鉴定细胞。多肽溶于NaOH溶液中，浓度为1％wt，PH=9.0，加DMEM/F12在盖玻片上触发多肽自组装为凝胶，TEM检测，实验组：NSCS接种于二维凝胶的表面；对照组：NSCS接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片表面；倒置相差显微镜观察NSCS生长及分化情况，免疫细胞化学染色，激光共焦显微镜观察。 将NSCS球接种于用预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片上，在NSCS球贴壁后，按以下分组进行诱导分化：（1）5μ mol/ml Forskolin、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF200 ng/ml神经基因调节剂（HRG），联合因子组；（2）10％血清，血清组；（3）20ng/ml bFGF，bFGF组。各组的培养基均为为DMEM/F12+B27添加剂。 用MAP2阳性细胞计数分化的神经元，Hoechst33342阳性标记数来计数细胞总数。NSCS的神经元分化率=MAP2+细胞数/Hoechst33342标记细胞数。用图像分析软件对采集图像中MAP2阳性的神经元的胞体面积、周长及细胞最长突起长度进行分析。 结果：免疫组化鉴定：无血清悬浮培养的细胞为NSCS，抗Nestin阳性。TEM示：凝胶为相互交织成网状的纳米纤维。实验组：7天后，IPCM观察到NSCS长出细长突起，对照组仅见未分化状态的NSCS球。LCM观察：实验组，NSCS发生分化，见神经元及星形胶质细胞，NF阳性，为较强红色荧光，GFAP阳性，为弱绿色荧光；对照组：只见NSCS球，Nestin阳性，为绿色荧光。 联合因子组：免疫荧光显示：MAP2阳性细胞沿着S100阳性细胞的突起向外周移行，生长，分化，到诱导10d后，MAP2阳性细胞也出现许多突起，有部分呈现TH免疫阳性。 血清组：免疫荧光细胞化学染色见细胞呈S100强阳性，Hoechst33342染色见细胞核较大，MAP2阳性细胞数量较少，胞体饱满。 bFGF组：免疫荧光检测：诱导3～5d后逐渐呈S100阳性，突起粗短。 结论：本课题采用机械分离，无血清悬浮培养出NSCS。TEM证实凝胶为网状纳米纤维。使用免疫细胞化学法进行细胞鉴定：凝胶对NSCS有较好的细胞相容性，NSCS在其表面可被诱导分化为神经元及神经胶质细胞。证实多肽自组装二维凝胶可作为一种神经组织工程支架材料。NSCS在联合因子和血清，bFGF条件下，生长分化存在显著差异.

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分神经干细胞的体外分离培养及鉴定

材料与方法

结果

讨论

第二部分新型组织工程多肽的设计合成及自组装成凝胶

材料与方法

结果

讨论

第三部分神经干细胞在肽自组装凝胶表面生长、分化的实验研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

致谢

综述 工程化的神经干细胞的研究进展

攻读学位期间的研究成果