新型三维多肽神经组织工程支架材料制备及体外诱导神经干细胞的实验研究

摘要

第一部分
　　 目的：探讨新生S-D鼠大脑皮层组织神经干细胞分离、培养以及鉴定的方法。
　　 方法：分离新生S-D鼠(出生1-3d 内)的大脑皮层组织，机械吹打后，无血清培养基悬浮培养细胞，获得具有自我增殖能力的细胞克隆，并将细胞克隆贴壁培养测其分化能力。应用抗Nestin、NSE、GFAP 免疫组织化学方法鉴定细胞克隆。
　　 结果：从新生S-D鼠大脑皮层组织分离的细胞悬液，经悬浮培养，生成大量具有增殖能力的细胞，可形成神经球，抗Nestin。细胞克隆贴壁培养后神经球分化为神经细胞及胶质细胞，抗NSE阳性，抗GFAP阳性。
　　 结论：上述方法分离的细胞具有自我更新、自我复制及分化为神经细胞及胶质细胞的能力，属于中枢神经系统干细胞。
　　 第二部分
　　 目的：设计合成含IKVAV的两亲性肽，在不同的条件下，探讨其自组装为三维多孔凝胶结构及其力学特性。
　　 方法：用固相法合成肽，MS测其分子量，HPLC测其纯度；肽溶于0.1M NaOH溶液中，配10，2，1，0.5wt[％]肽溶液，各取200ul相应肽溶液，分别加入等体积的DMEM/F12培养液，或置于10M浓盐酸蒸汽中，或涂布于盖玻片上，置于37℃干燥箱。TEM及SEM检测自组装形成的凝胶，用血流计测定凝胶的流变学特性。
　　 结果：MS示肽的分子量为1438.31，HPLC示其纯度为96[％]。肽溶液在DMEM/F12触发下，数秒钟内形成凝胶；于10M HCL蒸气中，2小时后完全形成薄层凝胶；37℃的干燥箱中，未见凝胶形成；SEM示10wt[％]肽形成的凝胶由纳米纤维构成，呈板层状排列，为多孔厚壁的结构。透射电镜显示：2，1，0.5wt[％]肽自组装凝胶由编织状纳米纤维构成。1wt[％]肽的凝胶纤维直径有3～5纳米，长度100纳米～1500纳米；2wt[％]肽的凝胶纳米纤维排列紧密；0.5wt[％]肽的凝胶的纳米纤维较细，纤维间空隙较大；时间频率流变学表明：损耗模量呈线性并且比存储模量要小，表明自组装凝胶有一定强度，有足够的强度可支撑细胞接种。
　　 结论：本实验合成两亲性肽，在DMEM/F12溶液中可自组装成多孔凝胶，成功构建了“聪明的”含活性配体神经组织工程支架材料。
　　 第三部分
　　 目的：体外培养出神经干细胞，接种于多肽自组装二维多孔凝胶表面，观察二维凝胶表面其对细胞生长及分化影响。
　　 方法：取乳小鼠大脑皮质，机械分离，无血清培养基悬浮法培养出神经细胞，免疫组织化学SABC鉴定。肽溶于NaOH溶液中，PH=9.0，浓度为1wt[％]，加DMEM/F12在盖玻片上触发多肽自组装为凝胶，透射电镜检测。实验组：神经细胞接种于二维凝胶表面；对照组：神经细胞接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片表面；倒置相差显微镜观察细胞生长及分化情况，免疫细胞化学染色，激光共聚焦显微镜观察。
　　 结果：免疫组化鉴定：培养的细胞为NSCs，Nestin(＋)。透射电镜示：自组装凝胶为交织成网状的纳米纤维。实验组：7天后，倒置相差显微镜观察到神经细胞长出突起，对照组仅有未分化神经干细胞球。激光共聚焦显微镜观察：在实验组，NSCs分化为神经元及星形胶质细胞，NF(+)，示强红色荧光，GFAP(+)，示弱绿色荧光；对照组：仅有神经干细胞球，Nestin(＋)，示绿色荧光。
　　 结论：本实验首次采用不需胰蛋白酶或EDTA，培养出神经干细胞。透射电镜证实凝胶为多孔的纳米纤维。免疫细胞化学鉴定：二维多孔凝胶对NSCs有良好的细胞相容性，其表面可诱导NSCs分化为神经元及胶质细胞。证明二维自组装凝胶可作为优良的神经组织工程支架材料。
　　 第四部分
　　 目的：合成两亲性肽，在含神经干细胞(NSCs)的DMEM/F12触发下自组装成三维多孔的凝胶，研究其对细胞生长及分化的影响。
　　 方法：固相法合成肽。取乳鼠大脑皮质，机械分离，无血清培养，免疫组织化学鉴定。实验组(EG)：分A1及A2亚组，1wt[％] 肽加入含细胞的等体积的DMEM/F12液中；对照组(CG)：分B1及B2亚组，细胞接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片表面，免疫细胞化学染色，LCM及IPCM观察，TEM检测细胞在凝胶中的超微结构。
　　 结果：MS示肽的分子量为1438.31，HPLC示其纯度为96[％]。TEM显示，凝胶为交织排列的纳米纤维。免疫组化鉴定：培养的细胞为NSCs，Nestin(＋)。IPCM观察：EG中，NSCs在凝胶内部，2天形成细胞球，7天形成神经元样形态；CG中，B1亚组仅形成细胞球，B2亚组细胞可形成神经元形态。LCM观察，EG中，NSCs分化为神经元与星形胶质细胞，NF(+)，GFAP(+)；CG：B1亚组可见NSCs球，Nestin(＋)，B2亚组为神经元与星形胶质细胞，NF(+)，GFAP(+)；TEM示在凝胶包裹的细胞的胞浆内有丰富的突起。
　　 结论：构建两亲性肽，自组装为凝胶，其内部可诱导NSCs发生分化，证明肽基凝胶可作为新型神经组织工程支架材料。