赣南脐橙皮中橙皮苷的提取、纯化及其活性研究

摘要

据目前研究,柑橘属类黄酮的单体种类约有60余种,主要包括黄酮、黄酮醇、黄烷酮以及花青苷,以黄烷酮最为丰富,其中橙皮苷含量最多,而且表现出非常重要的生物活性价值。本课题选用具有江西地方特色的资源--赣南脐橙皮为原料,提取、纯化脐橙皮中橙皮苷,并对其与DNA、IgG的相互作用进行了研究。结果如下:
　　 1.在紫外-可见分光光度法(UV-vis)的基础上,通过比较直接测定法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、AlCl3法、醇碱法,确定醇碱法测定脐橙皮中黄酮类化合物。同时通过比较UV-vis和高效液相色谱法(HPLC)测定粗品中橙皮苷的纯度,得出UV-vis(67.25％)较HPLC法(61.42％)测得的纯度高。为节约时间和成本,最终确定在提取及纯化的条件优化过程中用UV-vis法,HPLC的精确度更高,可用于样品最终纯度的测定。
　　 2.在单因素的基础上用响应曲面法对赣南脐橙皮中黄酮化合物的提取工艺进行了优化。结果表明:
　　 水浴提取赣南脐橙皮中黄酮化合物的最佳提取工艺为:提取温度69.96℃,乙醇浓度(体积分数)50.46％,液固比25.91:1,提取时间3.04h,提取一次,预测可获得黄酮化合物最大提取得率为2.97％,经验证黄酮化合物平均得率与预测值较为接近。
　　 超声辅助提取赣南脐橙皮中黄酮类化合物的最佳提取工艺为:提取温度75℃、乙醇浓度58.91％、液固比30.68:1、提取时间20.79 min、提取次数为2次,预测可获得最大黄酮类化合物得率为3.298％。对实验结果进行验证,在最佳实验条下做三次平行实验,平均得率为3.351％,与理论值相差0.053％。
　　 通过比较水浴和超声辅助提取黄酮类化合物,可见超声辅助法优于水浴提取。本实验选用超声辅助提取。
　　 3.通过D101、AB-8、NKA-Ⅱ、NKA-9四种大孔吸附树脂对橙皮苷静态吸附和解吸性能的比较,确定采用D101大孔吸附树脂纯化黄酮类化合物(主要为橙皮苷)。其最佳工艺条件是:上样浓度0.2mg/mL,左右:上样流速1mL/min；直接上样；洗脱液乙醇浓度为60％;解吸流速为上样流速1/2,即0.5mL/min；洗脱剂用量约为3BV。纯化后样品纯度最高达可达94.82％,富集倍数最高可达1.54,橙皮苷回收率为70.27％。D101可用于脐橙皮中橙皮苷的纯化。
　　 4.应用荧光光谱、紫外-可见光谱技术研究了在生理酸度条件下(pH=7.40)橙皮苷与免疫球蛋白(IgG)相互作用。研究发现,橙皮苷对IgG内源性荧光产生了猝灭作用,测定不同温度下橙皮苷对IgG的猝灭常数,得出橙皮苷对IgG的荧光猝灭为复合式猝灭方式；热力学参数表明,二者结合的主要驱动力为疏水作用力；同步荧光和三维荧光图谱表明橙皮苷能够使IgG的构象发生变化。
　　 5.采用紫外光谱法、荧光探针法、熔点实验及粘度实验,研究了在生理酸度条件下(pH=7.40)橙皮苷与DNA的作用方式。结果表明橙皮苷与DNA主要发生了嵌插作用。橙皮苷对DNA-EB体系的荧光猝灭属于静态猝灭,求得298K、304K和310K温度下,橙皮苷与DNA-EB相互作用的结合常数分别为0.69×104、1.29×104和1.79×104,橙皮苷与DNA有一个结合位点。