人诱导性多能干细胞向神经干细胞分化的实验研究

摘要

目的:
　　 诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem cells,iPS细胞)是通过成体细胞重编程技术产生的多能干细胞,具有分化为三个胚层细胞的能力,类似于胚胎干细胞。由于iPS细胞可来自自体的体细胞,其使用可避免胚胎干细胞面临的伦理及免疫排斥两大问题,显示出广阔的应用前景,为临床上多种难治性疾病的治疗开辟了新的思路。神经系统损伤的修复一直是研究的热点,利用神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)修复或替代受损的神经组织有望成为有效的治疗手段。由iPS细胞诱导而来的NSCs可解决NSCs的来源及免疫排斥等问题,具有极大的应用价值。本实验拟建立稳定的人iPS细胞培养体系,为今后iPS细胞的研究和应用提供高质量的研究材料；同时探讨体外诱导人iPS细胞向NSCs分化的方法,建立人iPS细胞来源的NSCs(iPS derived NSCs,iPSd.NSCs)培养体系,为iPS细胞应用于神经系统损伤性疾病的治疗奠定实验和理论基础。
　　 方法:
　　 1.人iPS细胞的传代培养。人iPS细胞接种于饲养层上,Ⅳ型胶原酶传代培养。
　　 2.拟胚体(Embryoid body,EB)的制备。消化iPS细胞集落,差速贴壁后悬浮培养4天。
　　 3.iPS细胞向NSCs定向诱导实验。实验分自然分化组(将EBs于EB培养基中培养)；RA诱导组(EBs于含维甲酸(Retinoic acid,RA)的EB培养基中诱导培养4天后,转移至EB培养基中继续培养)；RA+无血清培养基诱导组(EBs于含RA的EB培养基中诱导4天后转移至无血清培养基中筛选培养)。
　　 4.倒置显微镜下观察iPS细胞的生长情况及诱导过程中各组细胞的形态变化；RT-PCR检测iPS细胞中多能性基因Oct4和Sox2的表达；荧光实时定量PCR检测iPS细胞形成EB后多能性基因的变化及RA诱导后第7天各组细胞Nestin基因的表达；细胞免疫荧光染色法检测神经相关标志物Nestin、β-tubulinⅢ和GFAP的表达。
　　 5.收集RA+无血清培养基诱导组筛选获得的神经球(iPSd-NSCs)继续扩增培养,每天观察神经球的增殖情况,拍照记录并测量球体直径；检测神经球的分化能力及单个iPSd-NSC细胞的克隆形成能力。免疫荧光染色法检测克隆球Nestin及贴壁分化细胞β-tubulinⅢ和GFAP的表达情况。
　　 结果:
　　 1.人iPS细胞在饲养层细胞上稳定传代,形成致密的克隆,边界清晰。克隆内细胞排列紧密,细胞体积小、核大,细胞核/质比高。iPS细胞在多次传代后仍表达多能性基因Oct4和Sox2;去除饲养层后悬浮培养能形成EBs。与iPS细胞相比,EBs中多能性基因的表达明显下调。
　　 2.RA诱导后第3天,RA诱导组及RA+无血清培养基诱导组均观察到了环形rosette结构,并不断增多,到第7天均达高峰。RA诱导组rosette结构中有大量Nestin阳性细胞,这些细胞能分化为13-tubulinⅢ阳性的神经元,但GFAP阳性的星形胶质细胞少见。RA+无血清培养基诱导组rosette细胞易脱离瓶壁悬浮生长,形成神经球样克隆,克隆折光性强,表面可见新增殖的细胞突起。免疫荧光显示神经球呈Nestin阳性表达,神经球在含血清培养基中能分化为13-tubulinⅢ和GFAP阳性的细胞。自然分化组EB贴壁后,周围爬出成纤维样细胞,免疫荧光染色见少量Nestin,13-tubulinⅢ和GFAP阳性细胞。RA诱导后第7天,RA诱导组和RA+无血清培养基诱导组Nestin基因的表达量均明显高于自然分化组(p<0.05),分别为自然分化组的3.71±0.03和7.14±1.96倍；RA+无血清培养基诱导组Nestin基因的表达量亦比RA诱导组高(p<0.05),为1.93±0.52倍。同时,免疫荧光结果显示,自然分化组、RA诱导组和RA+无血清培养基诱导组Nestin阳性细胞率分别为23.77±2.96％、53.25±4.52％和87.54±3.67％,各组间P<0.05,差异有统计学意义。
　　 3.iPSd-NSCs在无血清培养基中稳定增殖,每6-8天传代一次,神经球直径不断增大；单个细胞培养一周后能形成神经球；在含血清培养基中,iPSd-NSCs能分化成13-tubulinⅢ阳性的神经元细胞和GFAP阳性的胶质细胞。
　　 结论:
　　 1.人iPS细胞在本实验室的培养体系下能稳定增殖,保持高度自我更新及分化潜能,说明本实验的培养体系适合人iPS细胞的稳定培养。
　　 2.RA能促进iPS细胞向NSCs分化；RA结合无血清培养基筛选法不仅能促进iPS细胞向NSCs分化,同时还能提高iPSd-NSCs的存活及增殖能力,是一种高效获得NSCs的方法。
　　 3.人iPSd-NSCs在无血清培养基中能稳定增殖,多次传代仍保持未分化状态及神经分化潜能,因此,本实验建立了稳定的iPSd-NSCs诱导培养体系,对NSCs定向诱导机制的研究及其临床应用具有重要意义。