ERK通路抑制剂对白蛋白诱导的人近端肾小管上皮细胞细胞外基质合成的影响

摘要

背景和目的：肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)是所有慢性肾脏疾病(chronic kidney diseases,CKD)进展到终末期肾病(end stage renaldisease,ESRD)的共同途径,其主要病理特征为肾间质成纤维细胞的增生和细胞外基质(如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原,纤维连接蛋白,层粘连蛋白)的过度积聚。早有研究表明蛋白尿不仅是肾脏损伤的标志,而且作为一个独立的致病因素参与肾脏疾病的进展。作为蛋白尿的主要成分,前期研究表明白蛋白可通过诱导细胞外基质积聚参与肾小管间质纤维化。许多研究表明,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)参与了肾脏生理及各种肾损伤过程,包括肾脏纤维化。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulatedkinase,ERK)信号通路是MAPKs家族的主要成员之一,而PD98059是ERK信号通路上的特异抑制剂。为进一步明确蛋白尿对肾小管上皮细胞的细胞外基质的影响,我们使用人血清白蛋白刺激体外培养的人近端肾小管上皮细胞株-HK-2细胞(human kidney epithelial cells,HK-2 cells),观察其细胞外基质的合成,并通过观察PD98059对人血清白蛋白诱导HK-2细胞细胞外基质合成的影响,探讨蛋白尿致肾小管间质纤维化的机制。
　　 方法：将体外培养的HK-2细胞随机分为4组:空白对照组(A组,未加刺激物)；人血清白蛋白刺激组(B组,人血清白蛋白浓度为5mg/ml)；PD98059刺激组(C组,PD98059浓度为10μmol/L):人血清白蛋白和PD98059共刺激组(D组,10μmol/L PD98059预处理HK-2细胞45min后再加入5mg/ml人血清白蛋白)。应用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测4组HK-2细胞在4个时间点(0、12、24、48 h)基质金属蛋白酶-9(matrix matalloproteinase-9.MMP-9)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)和Ⅳ型胶原(typeⅣ collagen,col-Ⅳ)mRNA的表达。
　　 结果：①与A组比较:B组MMP-9 mRNA的表达先增高后下降(均P<0.01),12 h达到高峰；B组TIMP-1 mRNA的表达呈时间依赖性增高(均P<0.01),24 h达到高峰；B组TIMP-1/MMP-9的比值则先下降后升高(均P<0.01),24h开始其比值高于A组；B组col-Ⅳ mRNA的表达呈时间依赖性增高(均P0.05)。与B组比较,D组TIMP-1/MMP-9的比值先升高后下降(p<0.05或P<0.01)；12 h时其比值高于B组(p<0.05)但仍低于A组(p<0.01)；24 h时其比值低于B组(p<0.01)但与A组比较无统计学差异(p>0.05)；48 h时其比值低于B组但高于A组(均P<0.01)。D组Col-Ⅳ mRNA的表达与B组比较显著下降(均P<0.01),48 h时其表达水平与A组比较无统计学差异(p>0.05)。0与A组比较,C组各时间点MMP-9、TIMP-1和col-Ⅳ mRNA的表达及TIMP-1/MMP-9的比值均无统计学差异(p>0.05)。
　　 结论:1、人血清白蛋白刺激HK-2细胞后,可导致MMP-9mRNA的表达先增高后下降；TIMP-1 mRNA的表达呈时间依赖性增加；TIMP-1/MMP-9的比值先下降后增高；col-Ⅳ mRNA的表达也呈时间依赖性增加。2、ERK通路抑制剂PD98059可降低人血清白蛋白刺激HK-2细胞后MMP-9、TIMP-1和col-ⅣmRNA的表达,并可部分纠正失衡的TIMP-1/MMP-9的比值。表明人血清白蛋白可能通过ERK通路,促进ECM的合成和抑制ECM的降解,诱导ECM积聚从而参与肾小管间质纤维化。