以血管平滑肌细胞为靶标的抗动脉粥样硬化功效成分筛选及其作用机制初探

摘要

血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖、迁移是引起心血管疾病的关键因素之一。抑制血管平滑肌细胞的增殖,维持血管功能正常,是进行血管疾病预防的重要措施之一。本课题以本实验室获得的体外培养人脐动脉血管平滑肌细胞,并以高浓度血清刺激细胞增殖建立其异常增殖模型,以传统医学中具有治疗“血瘀”效果的多种天然产物的活性成分如女贞子的齐墩果酸、当归的阿魏酸、决明子的1,8-二羟基蒽醌及山药的薯蓣皂苷元和大豆苷元及其衍生物等为研究对象,观察其活性成分对于血管平滑肌细胞增殖、迁移与粘附等细胞行为的影响变化,并初步探索了其影响机制。
　　 用组织植块贴壁法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外原代和传代培养。倒置相差显微镜观察血管平滑肌细胞的生长状态,确定其生长曲线,考马斯亮蓝R250染色观察细胞形态。结果原代培养细胞经三到四周的贴壁生长后迁移出植块并铺满瓶底,生长状态良好,在光镜下观察单个细胞呈长梭形,细胞束状排列,呈现漩涡状生长,生长汇合呈典型的“峰-谷”样,具有典型的平滑肌细胞特征。经传代培养至第5代,细胞生长特性未见异常改变。表明成功建立了人脐动脉血管平滑肌细胞系。
　　 以高浓度血清培养VSMC,刺激细胞增殖生长,建立了VSMC的增殖模型。结果显示:高浓度血清培养VSMC引起单位面积内细胞族簇生长,细胞数量显著增加,细胞达1.02×106个,而未增殖的对照组为6.7×105个；细胞核染色明显,反差增强；细胞总蛋白含量由对照组的6.216μg升高至10.964μg；BrdU对细胞DNA的掺入量由对照组的0.776μg增加到增殖组的1.3691μg,有明显的掺入增加；高浓度血清培养细胞48h后观察到细胞开始进入对数期,增殖生长提前,具有增殖特性；细胞G0／G1期的细胞数减少,进入S期的细胞数则明显增多,增殖指数达77.79％;增殖细胞的平面迁移能力明显提高,增殖细胞组的迁移数目为未增殖组的11.428倍,迁移距离为未增殖组的4.140倍；增殖组的细胞与细胞外基质蛋白粘附结合能力有所增加,与骨桥蛋白的粘附数目是未增殖组的2.042倍,与层粘连蛋白的粘附数目是未增殖组的1.742倍。因此,高浓度血清培养细胞影响细胞行为,引起VSMC的增殖、迁移与粘附,可用于体外增殖模型的研究。
　　 研究了各功效成分对红细胞溶血、血清氧化、组织脂质过氧化及·OH、·O2-和DPPH自由基的清除和对Fe3+的还原能力。功效成分根据其分子结构的不同,其抗氧化效果侧重不同。当归的主要功效成分阿魏酸主要通过清除自由基及还原Fe3+表现其抗氧化能力。对·O2-和DPPH自由基清除的IC50分别为119.33及4.57μg／mL；对Fe3+的相对还原能力是Vit C的2.118倍。女贞的功效成分齐墩果酸抑制红细胞溶血和肝匀浆脂质过氧化,IC50分别为277.72和213,.52μg／mL,对Fe3+还原能力是Vit C的2倍。山药功效成分1,8-二羟基蒽醌抑制血清自氧化、清除·O2-、·OH自由基,其IC50分别为359.32、65.91和48.57μg／mL。决明子功效成分薯蓣皂苷元抑制红细胞溶血和血清自氧化,其IC50分别为197.50μg／mL和95.37μg／mL；清除·OH和DPPH自由基,IC50分别为19.17μg／mL和1.84μg／mL。表明各功效成分可能通过对自由基清除、金属离子还原、蛋白结合等方式抑制脂质过氧化、红细胞溶血,降低血清自氧化,从而对血液氧化应激产生保护作用。
　　 从细胞形态、蛋白和DNA合成、细胞周期等方面研究了天然产物功效成分对VSMC增殖活性的抑制作用。功效成分影响细胞形态,延缓细胞生长,但均不具有明显细胞毒性。在终浓度为100μmol／L时,阿魏酸、齐墩果酸、1,8-二羟基蒽醌和薯蓣皂苷元抑制细胞相对活力,抑制率分别56.101、72.317、57.036和54.154％；抑制VSMCs蛋白合成分别达57.519、75.924、60.559和54.396％；降低DNA合成,BrdU掺入量由对照组的1.613μg下降为1.204、1.210、1.445和1.2.75μg；阻抑细胞周期,使PI指数由对照组的77.79％下降为65.26、60.28、71.36和59.85％,结果表明各功效成分对血清诱导的平滑肌细胞增殖有较好的抑制作用。此外,功效成分有效抑制血清刺激的VSMCs迁移和与细胞外基质蛋白的粘附。在浓度为100μmol／L时,阿魏酸、齐墩果酸组、1,8-二羟基蒽醌和薯蓣皂苷元对迁移细胞数目的抑制率分别达73.78、48.59、70.81和58.96％,同时对迁移距离的抑制率分别为67.69、70.90、59.36和62.56％,有效抑制血清刺激增殖的细胞迁移；对与骨桥蛋白粘附细胞数的抑制率分别达29.231、48.308、53.231和56.923％；同时对与层粘连蛋白粘附细胞抑制率分别为51.104、54.2598、64.038和67.192％。结果表明功效成分有效抑制VSMCs的增殖、迁移和粘附等行为,提示具有抗动脉粥样硬化作用。
　　 本实验研究了修饰的大豆苷元衍生物在平滑肌细胞体内的吸收代谢。大豆苷元衍生物DD1和DD2更易被血管平滑肌细胞吸收,48h时的吸收利用率分别达到71.672％和61.435％,均优于大豆苷元54.584％的吸收率；衍生物化合物在细胞内被持续代谢为原药,发挥其功效。对VSMC作用表明,大豆苷元衍生物浓度依赖性抑制VSMC增殖、迁移和粘附,没有明显细胞毒性。在100μmol／L时DD1、DD2及daidzein对VSMC增殖的抑制率分别可达84.47、68.53和66.35％；对迁移细胞数目的抑制率分别达58.52、54.07和49.63％；同时对迁移距离的抑制率分别为81.17、71.43和63.64％；对与骨桥蛋白粘附的细胞数目抑制率分别达48.308、47.077和46.769％；对与层粘连蛋白黏附的细胞抑制率分别达67.823、64.038和57.413％。此外,大豆苷元衍生物影响血清刺激的增殖HUVSMC细胞周期,与增殖对照组相比,DD1、DD2和daidzein使G0／G1期细胞增多,S期细胞减少,增殖指数分别为54.31％、56.39％和70.91％,均低于增殖对照组的77.79％。实验结果提示大豆苷元及其衍生物可能通过对VSMCs的增殖迁移的抑制具有抗动脉粥样硬化作用。
　　 对天然产物功效成分对VSMCs的NOS／NO调节作用进行了研究。结果表明,功效成分上调NOS相对活力,促进体系中NO的产生。在100μmol／L时,阿魏酸、齐墩果酸、1,8-二羟基蒽醌、薯蓣皂苷元组细胞中NO含量分别为20.749、31.797、18.624和16.250μmol／gprot,均高于对照组10.161μmol／gprot；NOS相对活力分别为1.008、1.061、0.900和0.798U／mgprot,均高于对照组0.668U／mgprot。NOS酶活力作用顺序与各组细胞中NO产生结果一致,均为:齐墩果酸>阿魏酸>1,8-二羟基蒽醌>薯蓣皂苷元,提示药物对细胞NOS活力造成调节,从而调节系统中NO的产生。
　　 为了观察血清培养对血管平滑肌细胞增殖的影响及功效成分对其的调控,实验采用real time PCR.检测了增殖细胞中周期相关因子mRNA的表达情况,初步探讨功效成分对血管平滑肌细胞增殖的调控。结果发现,血清培养细胞引起细胞增殖,细胞中CDK2 mRNA表达增强,p27kip1 mRNA表达受抑。和血清刺激组相比,功效成分组细胞CDK2 mRNA的表达受抑,p27kiP1mRNA的表达增强。表明:功效成分可能通过下调周期蛋白依赖性激酶,上调激酶抑制蛋白的表达来进行调控周期进程,从而影响细胞增殖。提示,功效成分对可能增殖细胞周期相关因子的催化活性部分进行干预,而不造成调节蛋白的表达抑制。但功效成分对血管平滑肌细胞增殖调控的确切机制有待进一步研究阐述。