玉米中伏马菌素B1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫学快速筛选方法研究

摘要

伏马菌素(Fumonisins,FBs)是主要由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)产生的有毒水溶性代谢产物,大多存在于玉米及玉米制品中。其中FB1是伏马菌素的主要组分,也是导致伏马菌素毒性作用的主要原因。FB1具有神经毒性、免疫系统毒性和致癌性等。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是主要由禾谷镰刀菌(Egraminearum)和黄色镰刀菌(Eculmorum)产生的化学结构和生物活性相似的有毒代谢产物,是一种单端孢霉烯族化合物,常污染玉米、小麦和大麦等谷物及其制品,具有免疫毒性、胚胎毒性和细胞毒性等。目前用于检测FB1和DON的方法主要有生物学鉴定法、理化检测法和免疫分析法等。其中免疫分析法具有灵敏度高、特异性好、样品前处理简单等优点,适合于大批量样品的现场快速检测。本实验在自制FB1-OVA、DON-BSA全抗原及抗FB1、DON单克隆抗体的基础上,分别建立了检测玉米中FB1和DON的直接竞争ELISA(Dc-ELISA)和同时检测玉米中FB1和DON的膜基质免疫分析法。
　　 本研究采用EDC法和CDI法分别制备FB1-OVA、DON-BSA全抗原,采用戊二醛一步法、戊二醛二步法、过碘酸钠法、三聚氰氯法、三聚氰氯快速法分别制备了不同质量投料比的抗FB1酶标抗体和抗DON酶标抗体。经效价和直接竞争ELISA测试后,比较得知以三聚氰氯快速法合成的抗FB1酶标抗体效价最高,可达1024000,IC50值最低,为3.0 ng/mL,该合成方法最简单,此时合成该酶标抗体需要的抗FB1单克隆抗体与HRP的质量投料比为1:2,抗FB1酶标抗体克分子比为2.92,酶结合率为51％,标记率为0.84454;以戊二醛二步法合成的抗DON酶标抗体IC50值最低,为75.3 ng/mL,该方法重复性最好,此时合成该酶标抗体需要的抗DON单克隆抗体与HRP的质量投料比为1:20,抗DON酶标抗体克分子比为2.69,酶结合率为3.345%,标记率为0.6935。
　　 利用抗FB1酶标抗体建立了检测玉米中FB1的直接竞争ELISA,经棋盘滴定确定,该方法的最佳FB1-OVA全抗原的包被浓度为1μg/mL,FB1酶标抗体(CC-1-FB1 McAb-HRP)的工作浓度为1:32000,IC50=2.97 ng/ml,检测范围为0.56～15.6 ng/mL,批内、批间变异系数均小于10%,回收率在83.8～93.2%,与FB2的交叉反应率为16%,与其他常见真菌毒素(DON,AFB1,OTA,ZEN,T-2,HT-2)未见交叉反应。
　　 利用抗DON酶标抗体建立了检测玉米中DON的直接竞争ELISA,经棋盘滴定确定,该方法的最佳DON-BSA全抗原的包被浓度为1μg/mL,DON酶标抗体(GA-2-DON McAb-HRP)的工作浓度为1:16000。IC50=77.267 ng/mL,检测范围为16.61～359.36 ng/mL,批内变异系数小于10%,批间变异系数为16.66%,回收率在90.28～97.7%,与常见真菌毒素(AFB1,OTA,ZEN,T-2,HT-2,FB1,FB2)未见交叉反应。
　　 以直接竞争ELISA为反应原理,聚偏氟乙烯膜为载体,建立了一种简便、快速、高特异性、可同时检测玉米中FB1和DON的膜免疫直接竞争分析法。样品前处理简单,整个过程只需一步加样,15 min内能目测判定结果,该方法获得的FB1、DON的检测限分别为2.5 ng/mL、50 ng/mL,使用有效期不少于180天,具有稳定性好、结果准确易于判定、经济实用等优点,非常适合于大批量样品的现场快速检测。
　　 采用自建的直接竞争ELISA和膜基质免疫分析法分别检测了市场上随机购买的35份玉米样本,检测结果与市售ELISA试剂盒和HPLC结果进行比较,经统计学分析无显著性差异,相关性良好。