XPD通过P53抑制乙型肝炎病毒复制、HBx表达和肝癌增殖

摘要

第一部分：重组质粒pEGFP-N2/XPD转染条件的优化及Pifithr in-α孵育条件的优化
　　 目的：
　　 本部分为探讨XPD与P53两者对HBV复制、肝癌细胞增殖凋亡以及HBx表达的影响，所以事先有必要优化重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染条件和Pifithrin-α的孵育条件。
　　 方法：
　　 将HepG2.2.15细胞种植于6孔板中。种板后第2天，利用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD分别按每孔0μg、2.1μg、4.0μg、6.0μg及8.0μg的浓度瞬时转染细胞。转染后48 h收获细胞，进行RT-PCR和Western blot以检测XPD表达的变化。将重组质粒pEGFP-N2/XPD以上述得出的最佳浓度转染细胞，转染后分别孵育0 h、24 h、48 h、72 h及96 h收获细胞，进行RT-PCR和Westernblot以检测XPD表达的变化。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况。在Pifithrin-α终浓度分别为0μM、10μM、20μM、30μM及400μM的条件下孵育细胞12 h，然后进行MTT检测。以上述得出的最佳浓度的Pifithrin-α分别孵育细胞0 h、12 h、24 h、36 h及48 h，然后进行MTT检测。
　　 结果：
　　 1.质粒转染浓度的优化
　　 RT-PCR和Western blot结果显示，XPD的表达在质粒浓度分别为每孔0μg、2μg、4μg范围内呈剂量依赖性升高(P<0.05)，其中4μg时XPD的表达为最高(P<0.05)。而每孔为4μg、6μg、8μg三者之间相比，XPD的表达无统计学差异(P>0.05)，即质粒浓度达到4μg/孔以后XPD的表达不再随浓度的增加而继续升高。因此，在后续的实验中选定4μg/孔为质粒转染的浓度。
　　 2.质粒转染后细胞孵育时间的优化
　　 RT-PCR结果显示，XPD mRNA的表达在质粒转染后细胞孵育时间分别为0h、24 h、48 h范围内呈时间依赖性升高(P<0.05)，而在48 h、72 h、96 h范围内呈时间依赖性降低(P<0.05)，其中48 h时XPD mRNA的表达为最高(P<0.05)。Western blot结果显示，XPD蛋白的表达在质粒转染后细胞孵育时间分别为0 h、24 h、48 h、72 h范围内呈时间依赖性升高(P<0.05)，而在96 h时回落(P<0.05)，其中72 h时XPD蛋白的表达为最高(P<0.05)。在后续的实验中选定48 h为质粒转染后细胞孵育时间。
　　 3.质粒转染成功的鉴定
　　 转染48h后，在荧光显微镜下，可在转染了重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2的细胞中观察到绿色荧光，而未转染质粒的细胞则未见绿色荧光，即转染成功。
　　 4.Pifithrin-α孵育浓度的优化
　　 MTT结果显示，A值在Pifithrin-α浓度分别为0μM、10μM、20μM范围内呈剂量依赖性升高(P<0.05)，其中20μM时A值为最高(P<0.05)。而浓度为20μM、30μM、40μM三者之间相比，A值无统计学差异(P>0.05)，即Pifithrin-α浓度达到20μM以后细胞增殖活力不再随浓度的增加而继续升高。因此，在后续的实验中选定20μM为Pifithrin-α的孵育浓度。
　　 5.Pifithrin-α孵育时间的优化
　　 MTT结果显示，A值在Pifithrin-α孵育时间分别为0 h、12 h、24 h范围内呈时间依赖性升高(P<0.05)，其中24 h时A值为最高(P<0.05)。而孵育时间为为24 h、36 h、48 h三者之间相比，A值无统计学差异(P>0.05)，即Pifithrin-α孵育时间达到24 h以后细胞增殖活力不再随孵育时间的增加而继续升高。因此，在后续的实验中选定24 h为Pifithrin-α的孵育时间。
　　 结论：
　　 本部分确定，在后续的实验中，将以浓度为4μg/孔的pEGFP-N2/XPD质粒转染HepG2.2.15细胞，转染后的第2天以浓度为20μM的Pifithrin-α孵育细胞24 h，转染后共孵育细胞48 h后收获细胞。
　　 第二部分：XPD通过P53抑制乙型肝炎病毒的复制
　　 目的：
　　 本部分研究XPD和P53两者对HBV复制的影响。
　　 方法：
　　 将HepG2.2.15细胞种植于6孔板中。种板后第2天，利用脂质体转染法将浓度为4μg/孔重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2瞬时转染HepG2.2.15细胞。转染后第2天，给予20μM的Pifithrin-α孵育24 h收获细胞。实验分为5组：(1)空白对照组；(2)pEGFP-N2组；(3)pEGFP-N2/XPD组；(4)pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组；(5)Pifithrin-α组。用RT-PCR检测HepG2.2.15细胞的XPD、HBsAg及HBeAg mRNA的变化；用Elisa法检测培养上清液中HBsAg和HBeAg的含量；用荧光定量PCR法检测培养上清液中HBV-DNA的含量。
　　 结果：
　　 1.XPD和P53对HBsAg、HBeAg mRNA表达的影响
　　 RT-PCR检测发现，与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组和pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的XPD mRNA的表达明显增多(P均<0.001)；与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的HBsAg和HBeAg mRNA的表达明显减少(P均<0.001)：与空白对照组相比，Pifithrin-α处理组的HBsAg和HBeAg mRNA的表达明显增多(P均<0.05)；与转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的HBsAg和HBeAg mRNA的表达明显增多(P均<0.001)；而空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间相比，差异无统计学意义(P均>0.05)。
　　 2.XPD和P53对培养上清液中HBsAg和HBeAg含量的影响
　　 Elisa检测发现，与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的培养上清液中HBsAg和HBeAg含量明显减少(P均<0.001)；与转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的培养上清液中HBsAg和HBeAg含量明显增多(P均<0.001)；而空白对照组、转染空载质粒pEGFP-N2组与Pifithrin-α组三者之间相比，差异无统计学意义(P均>0.05)。
　　 3.XPD和P53对培养上清液中HBV-DNA含量的影响
　　 荧光定量PCR检测发现，与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的培养上清液中HBV-DNA含量明显减少(P均<0.001)；与转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的培养上清液中HBV-DNA含量明显增多(P<0.001)；而空白对照组、转染空载质粒pEGFP-N2组与Pifithrin-α组三者之间相比，差异无统计学意义(P均>0.05)。
　　 结论：
　　 XPD能通过P53途径抑制HBV的复制。因此，XPD和P53可能成为乙型肝炎抗病毒治疗的作用靶点。
　　 第三部分：XPD通过P53抑制肝癌的增殖
　　 目的：
　　 本部分研究XPD和P53两者对肝癌细胞增殖凋亡的影响。
　　 方法：
　　 用脂质体转染法将浓度为4μg/孔重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2转染HepG2.2.15细胞。转染后第2天给予浓度为20μM的Pifithrin-α孵育细胞24 h。实验分为5组：(1)空白对照组；(2)pEGFP-N2组；(3)pEGFP-N2/XPD组；(4)pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α；(5)Pifithrin-α组。用MTT法观察细胞增殖活力；用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。
　　 结果：
　　 1.细胞增殖活力的变化
　　 MTT结果显示，空白对照组、pEGFP-N2组、pEGFP-N2/XPD组、pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组和Pifithrin-α组的A值分别为0.655±0.136、0.6334±0.119、0.114±0.055、0.528±0.076及0.934±0.201，差异有统计学意义(F=64.783，P<0.001)。重组质粒pEGFP-N2/XPD组的A值明显低于空白对照组和空载质粒pEGFP-N2组(P均<0.001)；Pifithrin-α处理组的A值明显高于空白对照组(P<0.001)；pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的A值明显高于重组质粒pEGFP-N2/XPD组(P<0.001)；而空白对照组与空载质粒pEGFP-N2组之间相比，差异无统计学意义(P=0.680)。
　　 2.细胞周期的变化
　　 流式细胞仪结果显示，空白对照组、pEGFP-N2组、pEGFP-N2/XPD组、pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组和Pifithrin-α组的G1期细胞分别占总细胞数的81.15％±2.31％、80.81％±1.88％、91.08％±2.90％、79.75％±1.79％及74.78％±2.01％(F=42.985，P<0.001)，G2期细胞分别占总细胞数的4.75％±1.16％、4.58％±1.07％、0.32％±0.42％、3.73％±1.76％、6.97％±0.39％(F=29.592，P<0.001)，S期细胞分别占总细胞数的14.10％±1.74％、14.61％±1.97％、8.60％±2.53％、16.52%±1.91％及18.25%±1.73％(F=19.954，P<0.001)，差异均有统计学意义。与空白对照组和空载质粒pEGFP-N2组相比，重组质粒pEGFP-N2/XPD组的G1期细胞明显增多(P均<0.001)，G2期和S期细胞明显减少(P均<0.001)；与空白对照组相比，Pifithrin-α处理组的G1期细胞明显减少(P<0.001)，G2期和S期细胞明显增多(P均<0.01)；与重组质粒pEGFP-N2/XPD组相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的G1期细胞明显减少(P<0.001)，G2期和S期细胞明显增多(P均<0.001)；而空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间相比，G1期细胞(P=0.794)、G2期(P=0.787)和S期细胞(P=0.662)差异均无统计学意义。
　　 3.细胞凋亡率的变化
　　 流式细胞仪结果显示，空白对照组、pEGFP-N2组、pEGFP-N2/XPD组、pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组和Pifithrin-α组的凋亡细胞分别占总细胞数的5.72%±0.64％、6.33%±1.12％、36.43％±3.12％、13.66%±2.18％及2.12％±0.80％，差异有统计学意义(F=341.606，P<0.001)。转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的细胞凋亡率明显高于空白对照组和空载质粒pEGFP-N2组(P均<0.001)；Pifithrin-α处理组的细胞凋亡率明显低于空白对照组(P=0.002)；pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的细胞凋亡率明显低于转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组(P<0.001)；而空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间相比，差异无统计学意义(P=0.570)。
　　 结论
　　 XPD抑制肝癌细胞生长和促进肝癌细胞凋亡的作用是通过P53途径实现的。
　　 第四部分：XPD通过P53抑制HBx的表达
　　 目的：
　　 本部分研究XPD和P53两者对HBx、P21、Bax、Bc1-2基因表达的影响。
　　 方法：
　　 用脂质体转染法将浓度为4μg/孔重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2转染HepG2.2.15细胞。转染后第2天给予浓度为20μM的Pifithrin-α孵育细胞24 h。实验分为5组：(1)空白对照组；(2)pEGFP-N2组；(3)pEGFP-N2/XPD组；(4)pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组；(5)Pifithrin-α组。用RT-PCR检测XPD、HBx、P21、Bax和Bc1-2表达量的变化；用Western blot检测XPD、P53、p-P53(ser-15)、HBx、P21、Bax和Bc1-2表达量的变化。
　　 结果：
　　 1.XPD、HBx、P21、Bax和Bc1-2 mRNA表达的变化
　　 RT-PCR检测发现，pEGFP-N2/XPD的转染明显增加了XPD mRNA的表达(P<0.001)；与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的P21和Bax mRNA的表达明显增多，而Bc1-2和HBx mRNA的表达明显减少(P均<0.001)；与空白对照组相比，Pifithrin-α处理组的P21和Bax mRNA的表达明显减少，而Bc1-2和HBx mRNA的表达明显增多(P均<0.01)；与转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的P21和Bax mRNA的表达明显减少，而Bc1-2和HBx mRNA的表达明显增多(P均<0.001)；空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间相比，差异无统计学意义(P均>0.05)。
　　 2.XPD、P53、p-P53(ser-15)、HBx、P21、Bax和Bc1-2蛋白表达的变化
　　 Western blot检测发现，pEGFP-N2/XPD的转染明显增加了XPD蛋白的表达(P<0.001)；与空白对照组和转染空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的P53、p-P53(ser-15)、P21和Bax蛋白的表达明显增多，而Bc1-2和HBx蛋白的表达明显减少(P均<0.01)；与空白对照组相比，Pifithrin-α处理组的P53、P21和Bax蛋白的表达明显减少，而Bc1-2和HBx蛋白的表达明显增多(P均<0.05)，但是p-P53(ser-15)的表达却无明显区别(P=0.909)；与转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组相比，pEGFP-N2/XPD+Pifithrin-α组的P53、p-P53(ser-15)、P21和Bax蛋白的表达明显减少，而Bc1-2和HBx蛋白的表达明显增多(P均<0.001)；空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间相比，差异无统计学意义(P均>0.05)。
　　 结论：
　　 XPD能通过P53途径上调P21和Bax的表达并下调HBx和Bc1-2的表达。同时也表明，XPD、P53和HBx三者之间能相互作用、相互影响，共同调节肝癌的发生与发展。