alpha-dystrobrevin基因在心肌致密化不全中的分子遗传学探讨及转基因动物模型构建

摘要

背景：心肌致密化不全（Noncompaction of the Ventricular Myocardium，NVM）是一种遗传性心肌病，与Tafazzin（TAZ），LIM域结合蛋白3（LIM domain binding3，LDB3），α-dystrobrevin（DTNA），他克莫司结合蛋白1A（FK506 binding protein1A，FKBP1A），核纤层蛋白1B（Lamin1B，LMNB1）及肌节蛋白基因（Sarcomere protein genes）等基因异常相关。DTNA位于常染色体18q12，其编码的蛋白位于心肌和骨骼肌的肌膜上参与细胞骨架结构，即可为心肌等细胞提供结构支持，还参与细胞间的信号转导作用。Notch基因对心脏发育起重要作用。在心肌小梁发育早期发现存在Notch信号活动。DTNA是否通过与发育相关的Notch信号通路对早期胚胎骨架形成产生影响？其异常是否会导致NVM这类遗传性心肌病的发生。目前这些机制仍然不明。
　　目的：筛查NVM患者DNA标本，寻找相关致病基因及变异。构建携带突变基因的转基因动物模型，以发现突变基因的致病机制及相关信号通路，为将来寻求基因治疗新靶点提供理论依据。
　　方法：对所收集的18例NVM患者DNA标本，以DNA直接测序法筛查候选基因TAZ，LDB3，DTNA，FKBP1和LMN的全部外显子、外显子-内含子交界区，并与100个正常人基因序列比对，寻找基因突变；用DnpI点突变策略将正常基因的cDNA定点突变，通过显微注射方法将突变基因注入小鼠受精卵中，构建成携带突变基因的转基因小鼠；对转基因小鼠进行Western Blot蛋白印迹观察、组织细胞学鉴定及心脏超声及游泳运动负荷实验等功能检测。同时，寻找与DTNA基因相关的信号通路。
　　结果：发现一例患者存在DTNA第4外显子上的第146位碱基A→G的错义突变（Asn49Ser，N49S）。经过构建α-MyHC-pSK-RSV-m87k（16.1）-DTNA Asn49Ser表达载体，获得可以将DTNA Asn49Ser突变基因遗传给子代并在心肌表达的mDB2/+转基因小鼠品系。mDB2/+小鼠心尖部的左心室壁疏松层可见多小梁结构，致密层（外层）肌纤维排列稀松，心室壁游离面的疏松层与致密层比值比阴性小鼠及野生型小鼠高。4月龄的mDB2/+小鼠左室后壁厚度明显大于mDB2/-小鼠及野生型小鼠，提示阳性鼠有心室肌壁增厚的改变，但与心室收缩及舒张功能相关的其他指标无明显变化。8月龄小鼠中的左心室室壁厚度比其他两组明显减小，提示左室壁变薄；虽然舒张末期的左室直径及容积和每搏输出量与其他组相比差异不大，但由于收缩末期左室直径及容积明显增大，左室射血分数及心肌缩短率明显降低，提示8月龄mDB2/+小鼠心肌收缩功能减退。小鼠游泳运动负荷实验显示，4月龄及8月龄小鼠，mDB2/+组，与mDB2/-组及野生型相比，运动耐受时间有减少趋势，但无统计学差异；12月龄小鼠，mDB2/+组，与与 mDB2/-组及野生型相比，运动耐受时间明显减少，有显著统计学差异（P＜0.01），mDB2/-组与Wildtype组间运动耐受时间无统计学差异。mDB2/+小鼠心肌中Notch1的表达量明显高于同代同龄阴性及野生型小鼠。
　　结论：DTNA Asn49Ser突变基因是NVM的致病基因；mDB2/+小鼠心尖部的左心室壁疏松层可见多小梁结构，致密层（外层）肌纤维排列稀松，心室壁游离面的疏松层与致密层比值比阴性小鼠及野生型小鼠高，有心肌致密化不全的疾病发展趋势。Notch1依赖的信号通路可能参与了与致病基因DTNA相关的心肌致密化的发生发展过程。

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略词表

第1章 引 言

1.1 心肌致密化不全

1.2 心肌致密化不全的分子遗传学

1.3 DTNA

1.4 与NVM基因相关的信号通路

第2章 心肌致密化不全患者突变基因筛查

2.1材料

2.2方法

2.3结果

2.4讨论

第3章 携带突变基因质粒构建

3.1材料

3.2方法

3.3结果

3.4讨论

第4章 转基因小鼠系的建立

4.1材料

4.2方法

4.3结果

4.4讨论

第5章 突变基因功能表达分析以及与心脏发育相关基因Notch的关系

5.1材料

5.2方法

5.3结果

5.4讨论

第6章 结 语

展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述一 干细胞治疗心血管疾病展望

综述二 先天性心脏病的发育遗传学

综述三 心房颤动基因学研究新进展

综述四 基因靶向技术和人类疾病小鼠模型