模拟皮肤发育构建含附件组织工程皮肤的初步研究

摘要

目的:应用刀片刮取法及酶消化法获取胎鼠和小鼠表皮细胞和成纤维细胞，对获得的表皮细胞和成纤维细胞进行培养、鉴定，并应用获得的表皮细胞作为种子细胞，PGA作为支架，初步构建含附件组织工程皮肤，为胎鼠表皮细胞的多向分化潜能提供良好的实验模型，并力求获得生物学性能更完整的组织工程皮肤，为临床应用提供更理想的生物修复材料。
　　方法:对刀片刮取法及酶消化法获取的胎鼠和小鼠表皮细胞，以角质细胞无血清培养基(K-SFM)进行培养，观察细胞生长状况及克隆形成情况，选择Pan-CK多克隆抗体对细胞进行鉴定;对酶消化法获取的胎鼠和小鼠成纤维细胞，以DMEM进行培养，观察细胞生长状况及克隆形成情况，选择vimentin单克隆抗体对细胞进行鉴定;应用培养的表皮细胞、成纤维细胞及PGA支架初步构建组织工程皮肤，观察形成皮肤及附件的情况。
　　结果:1.不同发育阶段胎鼠和小鼠皮肤组织结构观察揭示了皮肤附件的生长发育规律，即在胚胎14.5天(embryo14.5天，E14.5天)时，虽然表皮细胞仅为1-2层，但皮肤附件发育已经开始，E16.5天时是皮肤附件发育最为旺盛的时期，E18.5天皮肤附件发育基本完成，生后7天(postnatal7，P7)时皮肤附件发育成熟。
　　2.应用刀片刮取法能成功获取E14.5天的胎鼠表皮细胞，并能建立稳定的表皮细胞系。
　　3应用酶消化法能分别获取E16.5天，E18.5天，生后7天的胎鼠和小鼠表皮细胞及成纤维细胞，并能建立稳定的细胞系。
　　4.经培养出的E14.5天胎鼠表皮细胞、成纤维细胞和PGA支架构建的组织工程皮肤，组织切片可见人造皮肤大体形态比较接近正常皮肤，表皮分层分化较完善，可见基底层、棘细胞层及角化层。
　　结论:1.通过对不同发育阶段胎鼠和小鼠皮肤组织结构的观察，我们初步掌握了皮肤附件的生长发育规律。
　　2.刀片刮取法是一种获取E14.5天的胎鼠表皮细胞较好的方法，可以得到数量较多，细胞活力较好的E14.5天的胎鼠表皮干细胞。
　　3.消化法是一种获得E16.5天，E18.5天，生后7天的胎鼠和小鼠表皮细胞及成纤维细胞的稳定的细胞培养技术。
　　4.用E14.5天胎鼠表皮细胞、成纤维细胞和PGA支架构建的组织工程皮肤，表皮结构较好，基本形态比较接近正常皮肤。
　　本实验以PGA为支架，通过胚胎小鼠来提供表皮细胞和真皮成纤维细胞，从而首次构建含附件的组织工程皮肤的模型，为以后构建真正意义上的含附件的组织工程皮肤提供了可靠的理论和实验依据。

目录

声明

摘要

第1章 引言

1．1 概述

1．2 构建含附件组织工程皮肤的两个重要因素

1．2．1 多向分化潜能的种子细胞

1．2．2 适合的真皮来源的刺激信号

1．3 本研究的总体思路

第2章 基础材料、基础试剂及主要仪器

2．1 基础材料

2．2 基础试剂

2．3 主要仪器

2．4 其他试剂的配制

第3章 不同发育阶段胎鼠和小鼠皮肤组织结构观察

3．1 材料与方法

3．1．1 主要材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 方法

3．2 结果

3．2．1 不同发育阶段胎鼠和小鼠皮肤组织结构的变化

3．2．2 不同发育阶段的胎鼠和小鼠皮肤免疫荧光

3．3 讨论

第4章 不同发育阶段胎鼠和小鼠表皮细胞培养及鉴定

4．1 材料与方法

4．1．1 主要材料

4．1．2 主要试剂

4．1．3 方法

4．2 结果

4．3 讨论

第5章 不同发育阶段胎鼠和小鼠成纤维细胞培养及鉴定

5．1 材料与方法

5．1．1 主要材料

5．1．2 主要试剂

5．1．3 方法

5．2 结果

5．3 讨论

第6章 含附件组织工程皮肤模型的初步构建

6．1 材料和方法

6．1．1 主要材料

6．1．2 主要试剂

6．1．3 方法

6．2 结果

6．2．1 离体的E14．5天的胚胎小鼠皮肤体外器官培养

6．2．2 PGA支架材料的制备

6．2．3 用E14．5天胎鼠的表皮细胞构建复合皮肤

6．3 讨论

第7章 全文总结

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述