幽门螺旋杆菌致胃上皮细胞氧化性DNA损伤和APE-1表达关系的体外实验研究

摘要

目的：人类嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE-1)是修复氧化性DNA碱基损伤关键酶，具有氧化还原作用，是重要的转录调节因子，在修复由活性氧(ROS)引起的DNA损伤碱基切除修复通路中发挥核心作用。幽门螺旋杆菌(Hp)感染细胞可产生ROS及引起细胞内DNA损伤，而APE-1在Hp对胃粘膜上皮细胞(GES-1)氧化性DNA损伤中的作用尚不明确。因此，我们以不同浓度的Hp及在不同时间感染GES-1细胞，检测GES-1细胞中DNA损伤、8-OHdG含量、ROS变化及其APE-1的表达，以探讨Hp的致病机制致。
　　方法：⑴GES-1细胞培养:GES-1细胞培养采用含10％的胎牛血清、2％的青链霉素的高糖DMEM进行细胞培养，在Hp感染GES-1细胞之前细胞培养基换用无青莲霉素的含10％胎牛血清的高糖DMEM进行培养。⑵Hp的培养和活菌悬液制备:Hp固体培养:选择HpACTC43504(CagA+，VacA+)标准菌株，制备Hp活菌悬液，并进行鉴定。⑶Hp感染GES-1细胞模型的建立:采用对数生长期的Hp感染GES-1细胞，取细菌细胞比100∶1，Hp感染GES-1细胞0h、1h、3h、6h、12h、24h;分别取细菌细胞比0、50∶1、100∶1、150∶1、200∶1、300∶1，Hp感染GES-1细胞6h。⑷DNA损伤检测:采用单细胞凝胶电泳彗星实验检测DNA损伤和Elisa方法测量8-OHdG含量。⑸ROS水平检测:装载荧光探针荧光显微镜下观察细胞内ROS变化和荧光酶标仪定量测量细胞内ROS含量。⑹APE-1蛋白表达的检测:用Western Blotting、免疫细胞化学检测APE-1蛋白表达变化和APE-1细胞内定位情况。
　　结果：①Hp感染GES-1细胞DNA损伤和8-OHdG含量影响和变化:Hp感染细胞DNA损伤逐渐加重，随着时间延长彗星拖尾越明显，即损伤越明显，细菌细胞比为100∶1感染至24h时彗星拖尾最长，DNA损伤最重（图3.1，表3.1），各时间点之间差异有统计学意义(P＜0.05);不同浓度Hp感染GES-16h时，Hp浓度越高，拖尾越明显，DNA损伤越重（图3.2，表3.2），各浓度组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。8-OHdG含量相比空白组逐渐增加，随着时间延长8-OHdG含量逐渐增加，至感染24h时8-OHdG含量最高（图3.4，表3.3），且差异有统计学意义(P＜0.05);不同浓度Hp感染GES-1后，相比空白组8-OHdG含量均增加，浓度越高8-OHdG含量越高，至细菌细胞比为300∶1时8-OHdG含量最高（图3.5，表3.4），差异有统计学意义(P＜0.05)。②Hp感染GES-1细胞ROS水平变化:通过Hp感染GES-1后对细胞内ROS定量检测发现，24h内空白组ROS含量无明显，差异无统计学意义，细菌细胞比为100∶1时，ROS含量随感染时间延长而逐渐增加，至感染24h时ROS含量达最大值（图3.6，表3.5），差异有统计学意义(P＜0.05);不同浓度Hp感染GES-1时，相比空白组ROS含量均增加，且Hp浓度越高ROS含量越高，至细菌细胞比为300∶1时ROS含量最高（图3.8，表3.6），各浓度组差异有统计学意义(P＜0.05)。③Hp感染GES-1细胞APE1-1蛋白表达和细胞内定位变化:未感染Hp的GES-1细胞随时间变化未表现出明显变化，APE-1蛋白表达灰度基本一致，通过灰度值分析差异无统计学意义;Hp感染GES-1以细菌细胞比为100∶1时，APE-1蛋白灰度值变化随时间延长逐渐加深，至Hp感染GES-1细胞12h时灰度最深，感染24h时明显低于12h灰度，通过灰度值分析软件可得出APE-1在感染GES-112h时APE-1蛋白表达最高（图4.2，图4.3），各时间组差异有统计学意义(P＜0.05);不同浓度Hp感染GES-1时，Hp感染GES-1后灰度均深于空白组，至300∶1时APE-1灰度最深，通过灰度值分析软件300∶1时APE-1蛋白表达最高（图4.4，图4.5），差异有统计学意义(P＜0.05).另外通过免疫细胞化学结果，APE-1在细胞质中表达，Hp感染细胞后APE-1表达逐渐增加，染色逐渐加深，至感染12h时染色最深，感染至24h时染色低于12h染色，通过平均光密度值分析，随时间变化光密度值逐渐增加，感染24h的光密度值低于感染至12h的光密度值（图4.7，表3.7），差异有显著统计学意义(P＜0.05);不同浓度Hp感染细胞6h，感染Hp的细胞染色较空白组深，且Hp浓度越高染色越深，至300∶1时染色最深（图4.9，表3.8），通过平均光密度分析，空白组低于实验组光密度值，Hp浓度越高光密度值越高，差异有显著统计学意义(P＜0.05)。
　　结论：通过体外实验表明，Hp感染GES-1细胞可引起细胞内ROS含量增加、DNA损伤加重和8-OHdG含量增加，均与感染Hp浓度和感染Hp时间呈正相关。APE-1在细胞内普遍表达，正常GES-1胞质可表达APE-1，短时间感染Hp的GES-1细胞APE-1表达与DNA损伤和ROS含量呈正比例关系，APE-1蛋白表达增加，长时间感染Hp的GES-1细胞APE-1蛋白表达呈下降趋势。APE-1蛋白的表达变化与感染GES-1的Hp浓度及时间相关。APE-1胞质定位和蛋白表达可能与胞质增加的ROS相关，以修复胞质内由ROS增加导致受损的线粒体DNA。

目录

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摘要

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 实验细胞及细菌的选择

2．1．2 实验主要仪器设备

2．2 实验主要试剂和溶液配制

2．2．1 细胞培养和细菌培养主要试剂

2．2．2 Western Blotting所需要的主要试剂

2．2．3 测量细胞核DNA损伤所需要的主要试剂

2．2．4 细胞内ROS检测所需要的主要试剂

2．2．5 免疫细胞化学染色所需要的主要试剂

2．2．6 实验主要试剂配制方法

2．3 实验分组及实验方法

2．3．1 细胞、Hp培养

2．3．2 细胞培养、Hp和生长条件

2．3．3 Hp感染胃黏膜上皮细胞分组

2．3．4 单细胞凝胶电泳检测GES-1的DNA损伤

2．3．5 Elisa方法测量Hp感染GES-1前后8-OHdG含量

2．3．6 检测GES-1细胞内ROS变化

2．3．7 Western Blotting检测APE-1表达

2．3．8 免疫细胞化学检测细胞内APE-1表达

2．4 图像处理及分析方法

2．5 统计学处理

第3章 结果

3．1 单细胞凝胶电泳技术检测GES-1细胞内DNA损伤

3．1．1 Hp感染GES-1细胞24h内DNA损伤

3．1．2 不同浓度Hp感染GES-1细胞6h DNA损伤

3．2 Elisa方法检测Hp感染GES-1细胞后8-OHdG含量

3．2．1 24h内空白组和实验组8-OHdG含量比较

3．2．2 不同浓度Hp感染GES-1细胞6h时8-OHdG含量

3．3 GES-1细胞内ROS水平变化

3．3．1 Hp感染GES-1细胞24h内ROS变化

3．3．2 不同浓度Hp感染GES-1细胞6h ROS变化

3．4 Western Blotting分析APE-1表达

3．4．1 Hp感染GES-1细胞24h内APE-1表达

3．4．2 不同Hp感染GES-1细胞6h内APE-1表达

3．5 免疫细胞化学分析APE-1在GES-1细胞内定位和表达

3．5．1 Hp感染GES-1细胞24h内APE-1定位

3．5．2 不同浓度Hp感染GES-1细胞6h时APE-1定位

第4章 讨论

4．1 研究背景

4．2 Hp感染GES-1后DNA损伤变化及其意义

4．3 Hp感染GES-1后细胞内ROS变化及意义

4．4 Hp感染GES-1对APE-1表达和细胞内定位变化

4．5 Hp感染GES-1细胞DNA损伤、ROS变化和APE-1表达的关系

第5章 结论与展望

致谢

参考文献

综述 APE-1与幽门螺杆菌感染及胃癌的关系