红旱莲黄酮的提取、纯化及生物活性研究

摘要

红旱莲(Hypericum ascyron L)又名长柱金丝桃、湖南连翘，系藤黄科金丝桃属植物黄海棠的全草，主要分布在我国东北地区及黄河、长江和珠江流域。红旱莲全草入药，有平肝、止血、败毒、消肿的作用。据研究报道，红旱莲中主要的活性成分为槲皮素、山奈酚、金丝桃苷等黄酮类和氧杂蒽酮类化合物，其提取物具有抗炎、镇痛、抗氧化、组胺释放抑制等作用。目前，红旱莲中黄酮类化合物的提取、分离纯化以及提取物的相关生物活性等研究未见有系统的报道。
　　 本文对红旱莲中黄酮类化合物的提取、纯化及相关生物活性做了系统的研究，旨在获得这一药用植物资源中黄酮类活性成分的提取、纯化的最优工艺参数，探讨其相关生物活性，为综合开发利用红旱莲提供科学的理论依据和技术支持。主要研究内容及实验结果如下:
　　 1.通过对溶剂回流、超声辅助提取、微波辅助提取三种提取方法的初步比较，筛选出较优的提取方法——微波辅助提取法。结合响应曲面优化微波辅助提取相关参数，得出其最佳提取条件为:微波功率700W、微波时间4 min、乙醇体积分数56％、液固比42∶1，此条件下总黄酮得率为5.91％。
　　 2.通过静态吸附、解吸研究，对X-5、S-8、D101、AB-8、NKA-9、NKA-Ⅱ六种大孔吸附树脂进行筛选，得出NKA-9树脂的吸附率为79.41％，解析率为98.35％，对红旱莲黄酮同时具有较好的吸附和解析能力，是性能良好的总黄酮吸附剂。对NKA-9树脂分离纯化红旱莲黄酮的工艺条件进行了优化，静态吸附条件为:最佳吸附时间为6h，红旱莲黄酮样液初始浓度为3.5 mg/mL，样液pH6.0，吸附温度35℃;解吸条件为:洗脱剂乙醇体积分数60％，解吸液料比10∶1(60％乙醇溶液∶大孔吸附树脂，mL/g)。此条件下纯化后总黄酮纯度可由原来的13.78％提高到67.41％。
　　 3.通过高效液相色谱分析得出纯化后的红旱莲总黄酮主要含有槲皮素、山奈酚、芦丁、金丝桃苷、异槲皮素等黄酮类成分，总黄酮质量分数为47.7％。
　　 4.采用DPPH和羟基自由基清除能力、总还原能力、总抗氧化能力、β-胡萝卜素漂白实验以及抗DNA氧化损伤实验，评价了红旱莲总黄酮的抗氧化能力。结果表明，纯化后的红旱莲总黄酮具有良好的抗氧化能力，可作为一种新型的天然抗氧化剂。
　　 5.酪氨酸酶、黄嘌呤氧化酶、α-葡萄糖苷酶的抑制率测定、可逆性与抑制动力学的研究表明，红旱莲总黄酮是抑制作用较温和的、可逆的竞争型酪氨酸酶抑制剂，其半抑制率IC50为46.99μg/mL，抑制常数Ki为34.07μg/mL;是良好的可逆的竞争型黄嘌呤氧化酶抑制剂，其半抑制常数IC50为11.73μg/mL，抑制常数Ki为0.61μg/mL;是较好的可逆的混合型α-葡萄糖苷酶抑制剂，其半抑制常数IC50为0.237 mg/mL，抑制常数Ki为0.149 mg/mL和对酶一底物络合物抑制常数Kis为0.123 mg/mL。

目录

声明

摘要

第1章 综述

1．1 红旱莲研究进展

1．1．1 红旱莲化学成分研究

1．1．2 红旱莲药理作用研究

1．2 黄酮类化合物概述

1．2．1 黄酮类化合物的提取

1．2．2 黄酮类化合物的纯化

1．2．3 黄酮类化合物的生物活性

1．4 课题研究意义及主要内容

1．4．1 研究意义

1．4．2 主要研究内容

第2章 红旱莲中黄酮类化合物提取工艺的研究

2．1 实验仪器与试剂

2．1．1 实验设备

2．1．2 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．1 芦丁标准曲线的绘制

2．2．2 黄酮含量的测定

2．2．3 单因素实验

2．2．4 响应面实验设计

2．3 结果与讨论

2．3．1 微波辅助提取单因素实验结果分析

2．3．2 不同提取方法单因素实验结果比较

2．3．2 微波辅助提取红旱莲黄酮响应面分析

2．4 小结

第3章 红旱莲黄酮纯化工艺研究及成分分析

3．1 实验设备与试剂

3．1．1 实验设备

3．1．2 实验试剂

3．2 实验方法

3．2．1 样品制备

3．2．2 总黄酮含量测定

3．2．3 树脂的预处理

3．2．4 静态吸附解析实验

3．2．5 静态吸附动力学实验

3．2．6 NKA-9大孔吸附树脂纯化红旱莲黄酮的条件优化

3．2．7 产品中总黄酮含量的测定及相关系数的计算

3．2．8 红旱莲总黄酮的色谱分析

3．3 结果与分析

3．3．1 大孔吸附树脂的筛选

3．3．2 纯化工艺优化

3．3．3 黄酮纯度及相关系数的计算

3．3．4 黄酮纯化物中黄酮组分的HPLC分析

3．4 小结

第4章 红旱莲黄酮抗氧化活性研究

4．1 实验仪器与试剂

4．1．1 实验仪器

4．1．2 实验试剂

4．2 实验方法

4．2．1 红旱莲黄酮的DPPH自由基清除能力

4．2．2 红旱莲黄酮对羟基自由基清除能力的测定

4．2．3 红旱莲黄酮的β-胡萝卜素漂白能力测定

4．2．4 红旱莲黄酮还原能力的测定

4．2．5 红旱莲黄酮总抗氧化能力的测定

5．2．6 红旱莲黄酮的抗DNA氧化损伤能力测定

4．3 结果与讨论

4．3．1 红旱莲黄酮的DPPH自由基抑制作用

4．3．2 红旱莲黄酮的羟基自由基抑制能力

4．3．3 红旱莲黄酮的β-胡萝卜素漂白能力

4．3．4 红旱莲黄酮的总还原能力

4．3．5 红旱莲黄酮的总抗氧化能力

4．3．5 红旱莲黄酮抗DNA氧化损伤能力

4．4 小结

第5章 红旱莲黄酮的酶抑制作用研究

5．1 实验设备与试剂

5．1．1 实验设备

5．1．2 实验试剂

5．2 实验方法

5．2．1 酪氨酸酶的抑制作用检测

5．2．2 黄嘌呤氧化酶的抑制作用检测

5．2．3 α-葡萄糖苷酶的抑制作用检测

5．3 结果与讨论

5．3．1 红旱莲黄酮的酪氨酸酶抑制作用

5．3．2 红旱莲黄酮的XOD抑制作用研究

5．3．2 红旱莲黄铜的α-葡萄糖苷酶抑制作用研究

5．4 小结

主要结论及展望

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果