HER-2/neu小分子干扰RNA对脑膜瘤细胞增殖活性的影响

摘要

目的:
　　本课题将化学合成的特异性HER-2/neu小分子干扰RNA(HER-2 siRNA)瞬时转染至HER-2（人表皮生长因子受体-2）阳性的原代培养的人脑膜瘤细胞中，观察其对离体脑膜瘤细胞增殖活性的影响。
　　方法:
　　本课题收集外科手术切除的新鲜人脑膜瘤组织进行原代培养，用免疫细胞化学法筛选出HER-2抗体阳性的病例作为实验对象，然后将化学合成的特异性HER-2 siRNA瞬时转染至体外培养的HER-2阳性的人脑膜瘤细胞，实验分为四组:特异性HER-2 siRNA组;阴性对照siRNA组;脂质体组;细胞对照组。用MTT法直接测定转染前后脑膜瘤细胞增殖活性的改变;用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测转染前后脑膜瘤细胞中HER-2 mRNA的水平;采用免疫细胞化学法(ICC)检测转染前后脑膜瘤细胞中HER-2蛋白的水平，以及反映细胞增殖活性的Ki-67蛋白水平;Western Blot法检测转染前及转染后脑膜瘤细胞中HER-2蛋白的变化。探讨靶向阻断HER-2基因后脑膜瘤在细胞水平、RNA水平和蛋白水平表达的改变，从而观察HER-2基因与脑膜瘤生物学行为之间的关系。
　　结果:
　　特异性HER-2 siRNA瞬时转染至体外培养的人脑膜瘤细胞后，MTT实验结果发现特异性HER-2 siRNA从转染后48h开始对原代培养的人脑膜瘤细胞有抑制作用，其中转染后72h的抑制作用最强，细胞增殖抑制率可达50.08％，转染后96h的抑制作用与转染后72h比较没有显著差异;从RT-PCR实验结果可以看出，转染后72h，特异性HER-2 siRNA组脑膜瘤细胞中的HER-2 mRNA与GAPDH比值（即HER-2 mRNA相对表达量）比空白对照组明显降低;转染后72h，免疫细胞化学结果显示特异性HER-2 siRNA组脑膜瘤细胞中HER-2蛋白和Ki-67蛋白的表达较转染前明显减少;转染后72h，从Westem Blot实验结果可以看出，特异性HER-2 siRNA组脑膜瘤细胞中HER-2蛋白与GAPDH蛋白比值（即HER-2蛋白的相对表达量）较转染前明显减少。
　　结论:
　　在细胞水平，特异性HER-2 siRNA可以地有效抑制体外原代培养的人脑膜瘤细胞的增殖，同时在RNA水平和蛋白水平亦可有效地抑制HER-2基因的表达。HER-2基因与原代培养的人脑膜瘤细胞的生物学行为有密切关系。这就为难治性或者复发性脑膜瘤使用特异性HER-2 siRNA治疗提供了理论基础。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2．1 主要试剂和耗材

2．2．主要仪器设备

2．3 主要溶液配制

2．4 实验方法与步骤

2．4．1 收集病例

2．4．2 人脑膜瘤细胞的原代培养

2．4．3 转染

2．4．4 MTT法检测转染前后细胞增殖活性的变化

2．4．5 RT-PCR法检测转染前后细胞中HER-2 mRNA的变化

2．4．6 免疫细胞化学法检测转染前后细胞中HER-2蛋白及Ki-67标记指数的变化

2．4．7 Western blot法检测转染前后细胞HER-2蛋白表达的变化

第3章 结果

3．1 原代培养的脑膜瘤细胞鉴定结果

3．2 转染效率的评价

3．3 HER-2 siRNA转染前后脑膜瘤细胞的形态学观察

3．4 HER-2 siRNA转染前后MTT实验结果

3．5 HER-2 siRNA转染前后RT-PCR实验结果

3．6 HER-2 siRNA转染前后免疫细胞化学实验结果

3．7 HER-2 siRNA转染前后Western blot实验结果

第4章 讨论

4．1 人脑膜瘤细胞的原代培养

4．2 特异性HER-2 siRNA对离体脑膜瘤细胞增殖活性的影响

4．3 HER-2基因与脑膜瘤细胞生物学行为的关系

4．4 存在的问题与展望

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述 EGFR家族与人脑膜瘤关系的研究进展