缝隙连接蛋白43 Ser368位点磷酸化水平变化在ET-1诱导的脑血管痉挛中作用的研究

摘要

目的:
　　目前研究表明，Cx43 Ser368位点磷酸化状态对Cx43缝隙连接通道功能有着重要的影响，此位点磷酸化可通过调节Cx43蛋白的代谢过程以及Cx43通道的通透性和电导率等，调节缝隙连接通道功能。通过枕大池穿刺二次注血方法构建的蛛网膜下腔出血模型中，运用特异性抗Cx43 Ser368磷酸化抗体检测痉挛脑血管中蛋白表达情况时发现:Cx43 Ser368位点磷酸化水平与脑血管痉挛程度成正相关。为此，本次实验旨在改变脑血管壁细胞中Cx43 Ser368位点的磷酸化水平，观察Cx43 Ser368位点磷酸化水平的改变对脑血管痉挛程度的影响。通过上述研究进一步明确蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的病理机制，为预防和治疗蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛疾病寻找新的有效方法。
　　方法:
　　1、构建Cx43 Ser368A慢病毒载体:以pCMV-Cx43 cDNA质粒为模板克隆出目的基因Cx43 cDNA，并应用PCR技术定点突变Cx43 Ser368位点。运用Gateway技术构建真核表达载体PLV.Ex3d.p/neo-EF1 AIRES/EGFP质粒。筛选阳性质粒并测序鉴定，将含有突变Cx43 Ser368A基因的目的质粒和病毒辅助质粒经脂质体包裹后共同转染293T细胞，包装产生慢病毒，荧光显微镜下观察转染后的293T细胞EGFP表达情况，通过结晶紫染色法检测产生病毒液的滴度。
　　2、构建慢病毒感染脑基底动脉模型:运用枕大池穿刺注射方法向SD大鼠脑池内注入慢病毒液对SD大鼠进行造模，于造模后的14天、28天处死动物，取脑基底动脉快速冰冻切片，荧光显微镜下观察脑基底动脉各层组织中EGFP的表达情况，并对模型全脑行连续石蜡切片，HE染色后行光镜检查，以确认慢病毒是否引起组织炎症、坏死等。
　　3、慢病毒感染对ET-1所致脑血管痉挛影响:在建模后最佳感染时期对实验动物处死后断头取脑。将基底动脉制成动脉环和动脉条，用不同浓度的ET-1刺激血管环，应用生物信号采集处理系统观测血管环张力的变化。动脉条经相同刺激程序后，通过Wersten blotting技术对血管条中Cx43蛋白以及Cx43 Ser368位点磷酸化水平进行检测。
　　结果:
　　1、PLV.Ex3 d.p/neo-EF1 AIRES/EGFP产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳测定，其大小与理论值相符。质粒行DNA测序显示载体中目的基因序列与GenBank提供的大鼠Cx43基因编码序列子cDNA全序列一致（除突变位点），Cx43基因突变位点与设计相符，证明PLV.Ex3d.p/neo-EF1AIRES/EGFP质粒构建成功。病毒包装48小时后荧光显微镜观察可见细胞中有大量EGFP表达，表明转染的293T细胞中产生病毒，结晶紫染色法检测收集的病毒浓缩液滴度为9.7×107TU/ml。
　　2、脑基底动脉快速冰冻切片后荧光显微镜下观察显示:在注射慢病毒后的14天和28天后，脑基底动脉壁三层组织中均有EGFP的表达，且在感染28天后的脑基底动脉中观察到的EGFP最强。感染28天后的脑基底动脉经石蜡切片HE染色，在普通光镜显微镜下观察显示:脑基底动脉壁各层组织未见明显炎性细胞浸润，血管壁各层细胞分布均匀，细胞大小形态正常，细胞核完整，无核碎裂核溶解等现象，细胞无水肿、溶解、坏死，血管壁未见瘢痕形成，无纤维组织增生。
　　3、经各浓度ET-1刺激后，慢病毒感染组和正常组血管环的张力均有增强，呈浓度依赖性。在ET-1刺激浓度达到1×10-8 mol/L及以上时，慢病毒组血管环张力增强的幅度逐渐较正常组明显(P＜0.05)。
　　4、检测ET-1刺激后的脑基底动脉中Cx43蛋白表达及其磷酸化水平显示:正常脑基底动脉壁细胞中存在Cx43表达，而且Cx43 Ser368位点保持较低磷酸化水平。溶媒组与正常组比较无明显统计学差异(P＞0.05)。正常脑基底动脉经ET-1刺激后，Cx43表达明显上升，而且Cx43 Ser368位点的磷酸化水平也伴随着上升。与正常组比较两检测指标均有统计学差异(P＜0.05)。经慢病毒感染后，脑基底动脉壁细胞中Cx43表达上升，但Cx43 Ser368位点磷酸化水平被明显抑制。与正常组比较两检测指标均有统计学差异(P＜0.05)。慢病毒感染后的脑基底动脉经ET-1刺激后，Cx43表达明显上升，但Cx43 Ser368位点磷酸化水平仍然被明显抑制。与正常刺激组比较Cx43 Ser368位点磷酸化水平有明显统计学差异(P＜0.05)。
　　结论:
　　Cx43 Ser368位点磷酸化水平的降低可导致脑血管对致痉因子的致痉作用反应增强。其原因可能是因Cx43 Ser368位点突变（Cx43 Ser368位点磷酸化水平下降）导致Cx43缝隙连接通道大量开发，促进致痉因子在血管壁细胞之间的快速传播而引起脑血管痉挛。