缝隙连接蛋白43 Ser368位点磷酸化参与脑血管痉挛的体外实验研究

摘要

目的:
　　缝隙连接通道(GJ)介导的细胞间信号通讯(GJIC)是相邻细胞间电化学信号传递的最直接的通路，在血管协同舒缩的调节过程中起重要作用，其中缝隙连接蛋白43(Cx43)在血管壁分布最广泛，并主要通过磷酸化过程实现构象及功能的调节，前期体内实验研究表明在Cx43蛋白及其磷酸化水平与实验性蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管痉挛(CVS)的病理过程关系密切，本实验在此基础上，在体外细胞模型中进一步研究缝隙连接蛋白Cx43 Ser368位点磷酸化水平的改变在脑血管痉挛病理过程中可能的作用机制。
　　材料与方法:
　　1.原代培养与鉴定SD-大鼠基底动脉平滑肌细胞:无菌条件下迅速分离取出基底动脉，轻柔去除外膜和内膜，采用组织贴块法培养平滑肌细胞，光学相差显微镜观察细胞生长、细胞化学免疫荧光鉴定。
　　2.建立实验性脑血管痉挛细胞模型:原代培养的平滑肌细胞培养基中加入终浓度为10-6M OxyHb孵育24h、48h、72h、96h建立脑血管痉挛不同时段的细胞模型，通过随机双盲的方法，光学显微镜下测定平滑肌细胞的平均长度变化，并应用western blot检测细胞表型分子α-actin、calponin、OPN的表达变化来反应细胞收缩状态的改变，并检测Cx43总蛋白(T-Cx43)以及其Ser368位点磷酸化(P-Cx43)的比例水平改变，均数±标准差记录结果，采用t检验，进行统计分析。
　　3.Cx43 S368位点突变的慢病毒载体构建及鉴定:以pCMV-Cx43cDNA质粒为模板克隆出目的基因Cx43cDNA，并应用PCR技术定点突变Cx43 S368位点基因，再构建PLV.Ex3 d.p/neo-EF1 A(<)Cx43(>)IRES/EGFP真核表达载体质粒。测序鉴定后，以阳性目的质粒和辅助质粒共转染293T细胞，包装产生慢病毒，在荧光显微镜下观察转染后的293T细胞，并应用结晶紫染色法检测病毒滴度。
　　4.体外实验研究Cx43 Ser368位点突变对脑血管痉挛的影响:病毒载体感染平滑肌细胞效率检测，首先比较不同MOI值对细胞的感染效率的影响，其次观察24h、48h、72h、96h不同时间点的细胞感染效率，最后以最优MOI和最佳时间点感染平滑肌细胞，并检测蛋白水平的感染效率。实验分组为1）病毒组+OxyHb，2)空载病毒组+OxyHb，3）未感染+OxyHb，4）正常对照组（各组分别设置），观察相应时间点细胞收缩程度的变化，同时通过对收缩标记分子α-actin、calponin进行western blot检测进一步佐证细胞的收缩状态变化，同前检测T-Cx43表达及其中P-Cx43的变化情况。
　　结果:
　　1.原代培养的基底动脉平滑肌细胞经形态学观察及特异性抗α-actin抗体免疫荧光鉴定为平滑肌细胞并且纯度达到95％以上。
　　2.成功构建OxyHb诱导的脑血管痉挛细胞模型:细胞长度分别为正常时的69.26±19.23μm、24h为40.57±12.18μm、48h为29.98±20.19μm、72h为35.87±19.56μm、96h为42.25±17.94μm，即OxyHb能够诱导平滑肌细胞的收缩，且收缩程度随着孵育时间增加在48h时达到高峰，之后随着时间递增而逐步缓解，Western blot检测标记分子其中收缩型标记分子α-actin、calponin随着时间变化逐渐升高到48h时达到最大量分别为194.9％±20.9％（孵育前125.6％±20.5％），37.4％±7.8％（孵育前13.8％±9.3％），72h、96h则均逐渐降低其与细胞收缩程度的相关系数分别为-0.879和-0.945;合成型标记分子OPN相对表达量逐渐降低在48h时达到最小量7.4％±9.2％（孵育前26.7％±15.2），之后缓慢升高相关系数为0.957，说明标记分子的相对表达量能够很好证明细胞收缩程度的改变。且经过随着时间的递增T-Cx43的表达量逐渐升高并在48h时达到最高峰75.8％±4.1％（孵育前27.6％±18.5％），72h、96h较前(48h)逐渐下降，但仍高与正常对照水平，而P-Cx43的表达前期无明显变化，而从48h开始随着时间的递增其表达量明显升高，72h达到高峰49.2％±10.8（孵育前10.5％±16.3），在96h时仍有高峰表达较前(72h)略有下降，即P-Cx43占Cx43总蛋白的相对比在48h前不断降低，到48h达到最小值，而之后则逐步升高。
　　3.DNA测序表明成功构建PLV.Ex3d.p/neo-EF1 A(<)Cx43(>)IRES/EGFP质粒，Cx43 S368位点碱基成功突变为表达丙氨酸的碱基;荧光检测显示转染的293T细胞成功产生慢病毒，病毒浓缩悬液滴度测定为9.7x107TU/ml。
　　4.体外实验研究Cx43 Ser368位点突变对脑血管痉挛的影响结果:病毒感染平滑肌细胞效率检测:MOI值取100时，细胞的感染效率最高，且对细胞的生长无明显影响，自感染起24h左右即可观察到绿色荧光，到72h时达到高峰，感染率98％以上，且维持稳定，经Western blot检测P-Cx43在突变组72h之后处于低水平表达，说明感染效率在蛋白表达水平达到预期效果。突变组在OxyHb孵育后，细胞的长度变化24h(36.4±16.36μm)、48h(28.73±9.53μm)组与对照组24h为（38.64±16.32μm）、48h(30.96±19.98μm)无明显差异，而72h(28.12±14.66μm)组和96h(30.14±20.42μm)突变组的长度则明显小于对照组72h(36.46±17.53μm)、96h(45.34±17.94μm)，标记分子的蛋白相对表达量与细胞平均长度变化结果相符，而突变组中T-Cx43的表达较对照组无统计学差异，突变组P-Cx43也有升高但明显低于对照组，即P-Cx43占Cx43总蛋白的相对比前期无明显差异，但48h后一直处于较低值。
　　结论:
　　1.OxyHb孵育会诱导T-Cx43和P-Cx43表达升高，但时相性不同。
　　2.成功构建了表达Cx43 S368位点突变的慢病毒载体。
　　3.通过病毒感染特异性突变Cx43的主要磷酸化位点(S368)之后，导致OxyHb诱导的平滑肌细胞的收缩程度呈持续性，后期缓解不明显，说明Cx43S368的磷酸化对于脑血管痉挛的病理过程可能起到了保护作用，能够缓解CVS。这种保护机制可能与P-Cx43所占比例的升高导致通道功能减弱有关，进一步研究Cx43的磷酸化可能为防治脑血管痉挛提供新的思路和靶点。