PGD2-DP1受体途径对急慢性炎症疾病血管壁细胞的调控作用

摘要

第一部分：PGD2-DP1受体途径对急性胰腺炎微血管渗漏的保护作用
　　目的：
　　探索PGD2-DP1受体途径对急性胰腺炎微血管渗漏的影响及其分子调控机制。
　　方法：
　　1、建立雨蛙素诱导急性胰腺炎动物模型：分别利用C57BL/6/Sv129背景野生小鼠与DP1 KO小鼠，腹腔注射高浓度雨蛙素（50μg/kg）建立急性胰腺炎小鼠模型，同时给予腹腔注射PGD2（2mg/kg）/生理盐水治疗，监测血清淀粉酶及IL-6评价模型是否成功。
　　2、利用伊文思蓝实验、肺和胰腺组织湿干重比、肺组织损伤评分等评价PGD2对雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠微血管渗漏的影响。
　　3、利用免疫组化染色及RT-PCR方法观察雨蛙素诱导急性胰腺炎小鼠肺组织内炎性细胞的浸润和PGD2-DP1受体途径相关的酶COX-2、L-PGDS、H-PGDS和DP1受体的表达变化。
　　4、利用mDP1siRNA脂质体和pcDNA3.1/mDP1质粒对原代培养的野生小鼠与DP1 KO小鼠腹主动脉内皮细胞进行基因重组，利用Trans-well单层细胞通透性实验观察PGD2对血管内皮细胞屏障的影响。
　　5、利用Western blot方法及F-actin染色研究PGD2对基因重组血管内皮细VE-Cadherin表达及细胞骨架重构的影响。
　　6、利用完全pull-down实验和Western blot方法检测PGD2对基因重组血管内皮细胞Rho-GTPase活性和TRPC1表达的影响。
　　结果：
　　1、注射雨蛙素后小鼠血清淀粉酶、IL-6较注射前升高，肺组织大量炎性细胞浸润，肺间质水肿较正常对照组明显加剧，腹腔内注射超剂量雨蛙素能成功建立AP小鼠模型。
　　2、在急性胰腺炎野生和DP1 KO小鼠的肺组织内可见大量CD68+巨噬细胞浸润，PGD2代谢相关酶COX-2、H-PGDS及L-PGDS表达均升高，外源性PGD2减少急性胰腺炎野生小鼠的肺组织内CD68+巨噬细胞浸润的数量，但不能减少DP1 KO小鼠CD68+巨噬细胞浸润的数量。
　　3、急性胰腺炎DP1 KO小鼠表现较野生小鼠恶化的伊文思蓝渗漏、肺和胰腺组织湿干重比值以及肺病理损伤评分，外源性PGD2改善急性胰腺炎野生小鼠上述指标但对DP1 KO小鼠无效。
　　4、PGD2能明显抑制野生小鼠腹主动脉内皮细胞LPS诱导的单层血管内皮细胞通透性升高，利用DP1siRNA对WT小鼠血管内皮细胞DP1基因沉默后的和DP1 KO小鼠的血管内皮细胞，PGD2保护作用被抑制，pcDNA/DP1质粒转染恢复DP1 KO小鼠血管内皮细胞DP1表达后，PGD2的作用恢复。
　　5、PGD2能明显抑制WT小鼠血管内皮细胞 LPS诱导的TRPC1、VE-Cadherin、F-actin表达减少，但不能抑制DP1 KO血管内皮细胞LPS诱导的TRPC1、VE-Cadherin、F-actin表达减少，恢复DP1 KO血管内皮细胞DP1表达后，PGD2的作用恢复。
　　6、PGD2降低野生小鼠血管内皮细胞的GTP-Rac1、GTP-Cdc42活性，提高GTP-RhoA活性，DP1 KO血管内皮细胞PGD2的RhoA-GTP活性影响作用减弱，恢复DP1 KO血管内皮细胞DP1表达后，PGD2的作用恢复。
　　结论：
　　1、PGD2活化DP1受体改善急性胰腺炎小鼠肺内炎性细胞浸润，降低微血管渗漏。
　　2、PGD2活化DP1受体调节血管内皮细胞VE-Cadherin表达及细胞骨架重构,保护血管内皮屏障。
　　3、PGD2活化DP1受体可能通过调控Rho-GTPase活性和TRPC1表达从而调节血管内皮细胞VE-Cadherin表达及细胞骨架重构。
　　第二部分：PGD2-DP1受体途径在人腹主动脉瘤形成中的作用
　　目的：
　　了解PGD2-DP1受体途径相关的酶COX-1、COX-2和L-PGDS及DP1受体在人AAA组织中的表达定位，分析其与人AAA直径及破裂的相关性，探讨PGD2-DP1受体途径对人AAA的VSMCs表型变异及炎性细胞趋化的影响。方法：
　　1、采用免疫组化及免疫荧光染色方法，检测已破裂、未破裂AAA组织和正常胸内动脉组织COX-1、COX-2、LPGDS及DP1受体表达，同时进行HE、Masson染色明确人AAA的组织结构，利用抗α-actin和CD68抗体进行免疫染色标记VSMCs和巨噬细胞，明确这些相关酶及受体在人AAA组织中的表达部位。
　　2、利用RT-PCR方法检测人AAA组织中COX-1、COX-2、LPGDS及DP1受体mRNA表达，使用Western blot方法检测LPGDS及DP1受体蛋白的表达，结合临床资料记录的AAA直径和是否破裂进行相关性分析。
　　3、利用hDP1siRNA脂质体和pcDNA3.1/hDP1质粒对人外周血单核细胞和原代培养的人AAA组织VSMCs进行基因重组，使用IL-1β（5μg/l）单独或与PGD2（10μmol/l）共同孵育DP1受体基因重组和野生细胞株，观察PGD2对IL-1β诱导的单核细胞趋化和VSMCs表型变异的影响。
　　结果：
　　1、免疫染色标记提示AAA组织中VSMCs发生表型变异和迁徙，大量巨噬细胞浸润，VSMCsα-actin的表达量与人AAA的直径和破裂呈负相关。
　　2、COX-1、COX-2、LPGDS及DP1受体表达于人AAA组织的结构性细胞和炎性细胞，LPGDS的表达量与AAA的直径和破裂呈负相关，COX-2的表达量与AAA的直径正相关。
　　3、PGD2减少IL-1β诱导的野生株和DP1基因过表达株单核细胞趋化和VSMCs表型变异，但不能改善DP1基因敲除株单核细胞趋化和VSMCs表型变异。
　　结论：
　　1、人AAA中存在PGD2-DP1受体途径相关的酶及受体表达，且COX-2的表达量与AAA直径相关，L-PGDS表达量与AAA直径和破裂相关。
　　2、PGD2-DP1受体途径通过调控VSMCs的分化和表型变异及炎性细胞的趋化浸润在AAA形成中发挥重要的保护作用。

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中英文缩略表

第一部分：PGD2-DP1受体途径对急性胰腺炎微血管渗漏的保护作用

1 前言

2 材料与方法

2.1雨蛙素诱导AP动物模型的建立：

2.2血清IL-6测定：

2.3血清淀粉酶测定：

2.4微血管通透性的检测：

2.5小鼠肺组织mRNA提取、cDNA合成、实时定量RT-PCR

2.6小鼠肺组织苏木精伊红（HE）染色及肺损伤病理评分

2.7小鼠COX2免疫组织化学染色

2.8小鼠CD68免疫组织染色方法

2.9蛋白印迹（Western Blot）

2.10腹主动脉内皮细胞的分离及培养:

2.11 Lipofectamine 2000转染血管内皮细胞

2.12血管内皮细胞通透性实验

2.13 F-actin荧光染色（A12379Alexa Fluor? 488 Phalloidin ， Lifetechnologies）

2.14 Small GTPase检测(STA-405,Cell Biolabs, INC)

2.15统计学分析

3结果

3.1雨蛙素成功诱导AP小鼠模型

3.2 PGD2-DP1受体途径参与雨蛙素诱导的AP炎性反应的调控

3.3 PGD2激活DP1受体减少AP小鼠肺组织的CD68+巨噬细胞浸润

3.4 PGD2通过活化DP1受体减轻AP小鼠的微血管渗漏

3.5 PGD2通过活化DP1受体减轻LPS诱导的单层血管内皮细胞通透性

3.6 PGD2活化DP1受体减轻LPS刺激诱导VE-Cadherin表达及细胞骨架重构改变

3.7 PGD2活化DP1受体调控Rho-GTPase活性

3.8 PGD2活化DP1受体抑制LPS刺激诱导的TRPC1表达上调

4 讨论

5 结论

第二部分：PGD2-DP1受体途径在人腹主动脉瘤形成中的作用

1 前言

2 材料与方法

2.1病例资料及组织标本：

2.2人AAA组织苏木精伊红（HE）染色

2.3人AAA组织Masson三色染色

2.4人AAA组织α-actin免疫荧光染色

2.5人AAA组织CD68免疫组织化学染色

2.6人AAA组织COX-1免疫组织化学染色

2.7人AAA组织COX-2免疫组织化学染色

2.8人AAA组织L-PGDS免疫组织化学染色

2.9人AAA组织DP1受体免疫组织染色方法

2.10人AAA组织mRNA提取、cDNA合成、实时定量RT-PCR

2.11人AAA组织VSMCs的分离及培养

2.12 Lipofectamine 2000转染VSMCs及单核细胞

2.13单核细胞侵袭力检测

2.14蛋白印迹（Western Blot）

2.15统计学分析

3结果

3.1人AAA组织中的VSMCs表型变异和迁徙及巨噬细胞浸润

3.2人AAA组织中COX-1和COX-2的表达及变化

3.3 L-PGDS表达与人AAA直径与破裂相关性

3.4人AAA组织中DP1受体表达及变化

3.5 PGD2-DP1受体途径对人AAA组织VSMCs表型变异的影响

3.6 PGD2-DP1受体途径对单核细胞侵袭力的影响

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述一:前列腺素生物代谢与炎症性疾病

综述二:急性胰腺炎神经内分泌激素的变化及意义