siRNA抑制HMGA1基因表达对LX-2细胞生物学功能的影响

摘要

目的:
　　探讨HMGA1 siRNA对人肝星状细胞LX-2中HMGA1、a-SMA、E-cad基因的表达调控作用,及增殖活性的影响,并探讨其可能的机制。
　　方法:
　　1.选择体外培养LX-2细胞作为研究对象,分别设立以下六组:①正常对照组;②空白对照组;③阴性对照组;④转染HMGA1- siRNA-1;⑤转染HMGA1- siRNA-2;⑥转染HMGA1- siRNA-3。转染48h后收集各组细胞。采用半定量RT-PCR检测和Western blot印迹法检测HMGA1的mRNA和蛋白表达,筛选出干扰效果最佳的siRNA序列。
　　2.选择体外培养LX-2细胞作为研究对象,加入不同浓度的TGF-β1(终浓度1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml)孵育,并配对照组。于24h后收集细胞,提取LX-2细胞总RNA及总蛋白。用半定量RT-PCR及Western blot印迹方法检测TGF-β1对LX-2细胞HMGA1的mRNA和蛋白表达的影响。
　　3.采用脂质体转染法对LX-2细胞进行HMGA1 siRNA瞬时转染,将细胞分为4组:①正常对照组、②TGF-β1刺激组、③TGF-β1+ NC-siRNA组和④TGF-β1+ HMGA1-siRNA组。采用半定量RT-PCR及Western blot印迹法对LX-2细胞中HMGA1、α-SMA和E-cad的mRNA及蛋白表达水平进行检测,采用MTT法对LX-2细胞增殖水平进行检测。
　　结果:
　　1.半定量RT-PCR和Western blot印迹法检测HMGA1的表达:与正常对照组、空白对照组、阴性对照组相比,3个干扰组细胞 HMGA1基因和蛋白表达水平均明显降低(P﹤0.05),其中干扰组HMGA1-siRNA-1的干扰效果最好(P﹤0.01)。
　　2.随着TGF-β1剂量加大,HMGA1基因表达水平逐渐升高,各组间也有显著差异(P﹤0.05)。
　　3. TGF-β1刺激组与TGF-β1+NC-siRNA组之间细胞增殖水平及HMGA1、α-SMA、E-cad的基因及蛋白表达水平差异无统计学意义( P﹥0.05),细胞增殖水平及HMGA1、α-SMA表达均明显高于正常对照组(P﹤0.05),E-cad表达显著低于正常对照组(P﹤0.05),而TGF-β1+ HMGA1 siRNA组细胞增殖水平及HMGA1、α-SMA的基因及蛋白表达水平与TGF-β1刺激组及TGF-β1+NC-siRNA组相比均显著下降(P﹤0.05),E-cad表达水平显著增高(P﹤0.05)。
　　结论:
　　1.靶向HMGA1的siRNA能够沉默人肝星状细胞LX-2中HMGA1的表达,以HMGA1-siRNA序列1组沉默效果最好。
　　2. TGF-β1作用于人肝星状细胞LX-2,对HMGA1基因表达有显著的上调作用。
　　3.干扰HMGA1基因可显著抑制TGF-β1对人肝星状细胞LX-2中α-SMA基因和蛋白表达的促进作用;同时也可减轻对 E-cad表达的抑制作用,抑制TGF-β1诱导的人肝星状细胞LX-2增殖水平的升高,提示其参与了TGF-β1诱导的肝星状细胞活化。

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中英文缩略词表

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 细胞株

2.1.2 细胞培养试剂及材料

2.1.3 实验仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 常用试剂的配制

2.2.2 HMGA1-siRNA的设计和合成

2.2.3 人肝星状细胞株LX-2的培育

2.2.4 有效HMGA1-siRNA的筛选

2.2.5 TGF-β1浓度梯度对HMGA1表达的影响

2.2.6 HMGA1-siRNA对经过TGF-β1刺激后的LX-2细胞中HMGA1、a-SMA、E-cad表达的影响

2.2.7 RT-PCR检测各组细胞中HMGA1、a-SMA、E-cad的mRNA表达情况

2.2.8 Western Blot检测各组细胞HMGA1、a-SMA、E-cad的蛋白表达情况

2.2.9 四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖

第3章 结果

3.1 HMGA1基因沉默对LX-2细胞中HMGA1 mRNA、蛋白表达的影响

3.2 TGF-β1对LX-2细胞HMGA1 mRNA和蛋白表达的影响

3.3 HMGA1-siRNA对经过TGF-β1刺激后的LX-2细胞中HMGA1、a-SMA、E-cad mRNA和蛋白表达的影响

3.4 转染HMGA1-siRNA后LX-2细胞增殖活力的变化

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表文章

综 述