幽门螺杆菌CagA、VacA及外膜蛋白HomA、HomB多态性与疾病的关系

摘要

研究背景与目的:
　　幽门螺杆菌(H.pylori)感染的结局是多样性的,可以是无症状细菌携带,也可以引起慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤。H.pylori感染后的结局主要受细菌、宿主和环境因素三者的影响,其中细菌因素起重要作用,而H.pylori致病因子基因多态性是其重要原因。H.pylori的细胞毒素相关蛋白基因(cagA)及空泡毒素相关基因(vacA)是H.pylori两个最重要的致病毒力因子,近年研究发现H.pylori的外膜蛋白homB在其致病中也起重要作用。在我国大部分H.pylori菌株都带有vacA和cagA基因,因此无法单纯地用它们的表达来确定其毒力作用及其和疾病的相关性。近年研究表明vacA基因信号区、开码读框的中间区和基因的中间区域的基因多态性,以及CagA EPIYA基序的多态性与疾病的转归有关。国外学者研究表明HomA和HomB参与了H.pylori的致病,但所得结果不一致,这可能与它们的基因多态性和地域差异有关。本文观察了来自不同疾病的170株临床分离的H. pylori菌株的cagA、vacA、homA和homB基因的表达,并同时进行了vacA分型,CagA的EPIYA基序分型和homB基因的全长测序,以期分析这三个基因及它们的基因多态性与疾病的关系。
　　方法:
　　1.H.pylori外膜蛋白HomA及HomB的基因检测:
　　(1)对前期分离的170株临床H.pylori菌株进行复苏培养,并提取其基因组DNA;
　　(2)对提取的基因组DNA进行稀释,以备后用;
　　(3)对homA和homB基因中间区域的差异片段进行引物设计,从而可以检测出表达homA和homB的菌株;
　　(4)进行PCR扩增,在琼脂糖凝胶电泳上出现homB161bp,homA128bp的两个条带,分别得到表达homA和homB的菌株。
　　2. H.pylori外膜蛋白HomB基因序列特征及CagA(EPIYA)、VacA(s/i/m)基因分析
　　(1)针对H.pylori外膜蛋白HomB、CagA(EPIYA)及VacA(s/i/m)基因序列合成多对特异性测序引物;
　　(2)对目的基因进行扩增,并将其产物送华大基因公司测序;
　　(3)得到homB和CagA(EPIYA)的测序结果,以及VacA(s/i/m)分型结果,利用生物信息学软件—Primer5.0、MEGA、AlignX,及相关信息数据库进行DNA序列和氨基酸序列比对,分析外膜蛋白HomB以及两种毒力基因的多态性与临床疾病、病理之间的联系。
　　3.统计学处理
　　计数资料采用卡方检验或Fisher确切概率法进行处理,应用SPSS17.0统计软件进行分析,p<0.05有统计学意义。
　　结果:
　　1.CagA羧基端可变区(EPIYA)氨基酸序列的特征分析:
　　在来自临床分离的H.pylori170株中,100％表达cagA基因。通过测序得到cagA3′端可变区序列全长,其DNA序列翻译为氨基酸后CagA的C端可变区起始于5个或6个多聚天门冬氨酸NNNNNN,终止于LSKVG序列。其EPIYA基序数量为0~4个:4株含有4个EPIYA基序,其中两株为胃癌株;2株含有2个EPIYA基序的均为慢性胃炎株;3株EPIYA基序缺失的突变株;161株3个EPIYA基序的菌株无明显的疾病相关性。所有 H.pylori菌株可分为三种序列型—即含有2个EPIYA基序的AB型、含有3个EPIYA基序的ABD型和含有4个EPIYA基序的AABD型,均为东方型(TIDD)。
　　进一步分析EPIYA基序中的多态性发现:2株EPIYA-A突变的H.pylori均来自慢性胃炎患者,而9株EPIYA-B突变的H.pylori菌中的2株来自胃癌患者,7株来自十二指肠溃疡患者,表明EPIYA-B突变株致病性更强。
　　2. vacA基因分型:
　　对170株H.pylori vacA基因进行PCR扩增,除第152株菌i1、i2不表达外,其余菌株均为s1a/m2/i1型,与疾病无相关性。由于vacA基因分型是:s1型有毒力、s2型没有毒力,同样的m1型的毒力强于m2型,i1型有毒力而i2型弱或无毒力。提示江西地区的菌株,其vacA的基因型较为保守,表达集中,且大部分均为中等强度毒力菌株,它们导致不同的疾病可能是多个毒力因子共同作用所致。
　　3.H.pylori外膜蛋白HomA和HomB基因的表达:
　　(1) homA和homB在临床疾病中的分布
　　①在来自临床分离的H.pylori170株中,其中27株来自胃癌、20株来自胃溃疡、75株来自十二指肠溃疡、48来自株胃炎;
　　②homA单阳性率为14.7%(25/170),其在胃癌、胃溃疡、十二指肠溃疡和胃炎的阳性率分别为22.2%(6/27)、20.0%(4/20)、13.3%(10/75)、10.4%(5/48),各组间无显著差异(p>0.05);
　　③homB单阳性率为70%(119/170),其在胃癌、胃溃疡、十二指肠溃疡和胃炎的阳性率分别为74.1%(20/27)、75.0%(15/20)、68.0%(51/75)、68.8%(33/48),各组间无显著差异(p>0.05);
　　④homA和homB双阳性率为15.3%(26/170),其在胃癌、胃溃疡、十二指肠溃疡和胃炎的阳性率分别为3.7%(1/27)、5.0%(1/20)、18.7%(14/75)、20.8%(10/48),其中胃癌组与胃炎组中表达有统计学差异(p=0.044),其余各组间无显著差异。
　　(2)homA和homB在临床病理中的分布
　　①在来自临床分离的H.pylori170株中,其中90株(十二指肠溃疡者及5株慢性胃炎患者未进行病理学检查)有临床病理检测结果、42株为慢性浅表性胃炎、21株为肠上皮化生(肠化)和不典型增生、27株为胃癌;
　　②homA单阳性率为14.4%(13/90),其在慢性浅表性胃炎、肠化和不典型增生、胃癌的阳性率分别为9.5%(4/42)、4.3%(3/21)、22.2%(6/27),各组间(p>0.05)无显著差异;
　　③homB单阳性率为68.9%(62/90),其在慢性浅表性胃炎、肠化和不典型增生、胃癌的阳性率分别为64.3%(27/42)、71.4%(15/21)、74.1%(20/27),各组间(p>0.05)无显著差异;
　　④homA和 homB双阳性率为16.7%(15/90),其在慢性浅表性胃炎、肠化和不典型增生、胃癌中的阳性率分别为26.2%(11/42)、14.3%(3/21)、3.7%(1/27),homA和homB双阳性在三种病理中表达有统计学差异(p=0.047),同时在胃癌组与慢性浅表性胃炎组中表达也有统计学差异(p=0.016),其余各组间无显著差异。
　　4.homB基因测序与比对分析
　　homB基因阳性的145株中,经过3次优化条件的PCR和测序,最终仅获得了59株菌的完整全长序列。其中胃癌株的测序成功率(9.5%)显著低于其它3组(50.0%~66.7%)(p<0.05)。基因测序失败的原因目前认为主要是因为基因序列本身的高级结构、重复序列以及高GC含量等,导致测序时出现结合、杂合等所致,而胃癌株测序成功率低,提示其高级结构复杂或重复序列多,这可能是胃癌株毒力较强的原因之一。
　　将这些序列利用MEGA和AlignX等生物信息学软件逐个进行校对后再与标准序列进行分析比对发现homB整个基因序列的变化很大,且100~1600位点上基因多态性较强,后半部分变化比较小,但整个序列的保守性较差。这59株H.pylori的homB基因序列无明显的疾病聚集性,这可能是因为结构复杂和多态性强的菌株未能成功测序所致。
　　将江西地区的homB基因与国外的14株标准菌株的homB基因输入MEGA软件进行比对和聚类分析,发现突变广泛存在于不同区域的菌株中;东西方国家标准菌株之间存在较大差异性;江西地区菌株与东亚国家(日本,韩国)标准菌株之间也存在较大差异性。同时江西地区的菌株以及日本和韩国国内的标准菌株均无明显的地区聚集性,并且西方国家的标准菌株分布更为离散。
　　结论:
　　1.江西地区cagA基因的阳性率为100%,明显高于其他地区,且cagA基因均为东亚型。
　　2.H.pylori的致病性会随着CagA EPIYA基序数量的增加而增强,EPIYA-B突变的致病性强于EPIYA-A突变株和无突变株。
　　3.江西地区的vacA基因,除一株菌i型无表达外,其余均为s1a/m2/i1型,且不同疾病中其毒力也无明显差异。
　　4.江西地区的H.pylori菌株,homA基因阳性率要低于homB基因,同时homB阳性率远高于西方国家。
　　5.homA和homB单阳性在各疾病中无显著差异,但homA和homB基因双阳在胃癌株中显著低于慢性胃炎,同时胃癌株homB基因测序失败比例显著高于其它3种疾病,提示胃癌株homB基因的高级结构复杂,重复序列多。

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中英缩略词表

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1.菌株

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.2方法

2.2.1主要溶液的配制

2.2.2 H.pylori的复苏、培养与鉴定

2.2.3 H.pylori基因组的提取

2.2.4 引物设计

2.2.5 PCR扩增反应

2.2.6 统计学处理

第3章 结果

3.1 cagA羧基端可变区（EPIYA）氨基酸序列的特征分析

3.2 vacA基因分型结果

3.3幽门螺杆菌外膜蛋白HomA及HomB的基因检测:

3.4 homB基因测序与比对分析结果

第4章 讨论

4.1 cagA及其多态性与疾病的关系

4.2 vacA及其多态性与疾病的关系

4.3 homA和homB及其多态性与疾病的关系

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述