microRNA-7靶向调控FAK的表达对人结肠癌细胞增殖及迁移的影响

摘要

研究背景:
　　结肠癌是国内外最常见的恶性肿瘤之一,也是引起肿瘤相关死亡的重要死因之一。我国结肠癌的发病率呈逐年上升趋势,目前结肠癌的总体治疗效果仍不满意,尤其是已发生转移的结肠癌往往治疗效果及预后差,患者的生存质量受到严重影响,随着对分子靶向治疗研究的深入,越来越多的与肿瘤有关通路的分子靶点治疗出现使结肠癌的治疗有了新的手段。相对传统的肿瘤研究的分子如基因、mRNA、蛋白等,microRNA作为一种新奇的研究热点,具备了更多成为肿瘤标记物及治疗靶标的素质。
　　MicroRNA是一类长约18-25个碱基的非蛋白编码的单链小分子 RNA,其通过碱基互补配对的方式识别靶 mRNA,并根据互补的程度不同抑制靶 mRNA翻译或者像 siRNA功能一样降解 mRNA,从而负性调节调控靶基因表达。microRNAs功能研究不断深入,它发挥着癌基因或抑癌基因的作用来影响细胞周期,细胞凋亡、细胞迁移及血管生成等作用,并与许多肿瘤的诊断、分类分期和预后关系密切,其发挥的重要作用离不开靶基因的改变。
　　黏着斑激酶(Focal Adhesion Kinase,FAK)是一种存在于胞质的非受体蛋白酪氨酸激酶,主要参与胞膜整合素多信号转导引起的细胞生理活动,因此作为整合素介导信号转导过程中的中心分子参与细胞粘附、迁移、骨架重组、增殖等过程。研究显示FAK可作为microRNA-7的靶基因,其靶向FAK mRNA3’非编码区从而调节其翻译影响肿瘤的生长、转移及多种生物功能。我们的前期研究显示在结肠癌组织中FAK的表达高于癌旁组织,为此,本研究从体外细胞学方面研究miR-7通过靶向FAK影响结肠癌的迁移及增殖能力,为结肠癌的治疗寻找新的靶标。
　　目的:
　　本研究通过体外研究microRNA-7(miR-7)对FAK蛋白的影响及其对人类结肠癌细胞增殖及迁移能力的研究,明确miR-7靶向调控FAK蛋白的表达对结肠癌细胞的增殖及迁移能力的影响。
　　方法:
　　传代培养人类结肠癌细胞Caco-2和HCT-8,通过脂质体转染miR-7 mimic或inhibitor上调或下调miR-7的表达,并用荧光染色及Real-time PCR的方法检测转染效率。通过Western Blot方法检测miR-7变化后结肠癌细胞FAK及相关迁移蛋白如MMP-2和MMP-9蛋白的表达变化。通过MTT方法检测miR-7变化后结肠癌细胞的增殖能力的变化。通过划痕实验检测 miR-7改变后结肠癌细胞的迁移能力的变化。利用统计软件SPSS18.0进行统计处理,各实验均重复3次。
　　结果:
　　1. miR-7 mimic及miR-7 inhibitor通过脂质体成功转染入人类结肠癌细胞并成功调节miR-7的表达。miR-7 mimic转染入细胞后通过qRT-PCR的检测显示miR-7表达上升,而 miR-7 inhibitor转染入细胞后 miR-7表达下降,通过转染miR-7 mimic negative-5’-cy3入结肠癌细胞后行荧光检测显示转染效率几乎达100％。
　　2. miR-7上调后结肠癌细胞的FAK蛋白表达下降。结肠癌细胞转染miR-7 mimic后检测FAK的表达,与转染miR-7 mimic negative的阴性对照组及未转染的空白组成明显下降趋势(P≤0.05)。
　　3. miR-7下调后结肠癌细胞的FAK蛋白表达上升。结肠癌细胞转染miR-7 inhibitor后检测FAK的表达,与转染miR-7 inhibitor negative的阴性对照组及未转染的空白组成明显上升趋势(P≤0.05)。
　　4. miR-7表达改变后结肠癌细胞的增殖能力发生相应的变化。结肠癌细胞转染miR-7 mimic后检测细胞增殖能力,与转染miR-7 mimic negative的阴性对照组及未转染的空白组成明显下降趋势。结肠癌细胞转染miR-7 inhibitor后增殖能力,与转染miR-7 inhibitor negative的阴性对照组及未转染的空白组成明显上升趋势(P≤0.05)。
　　5. miR-7表达下调后结肠癌细胞的迁移能力发生相应的变化。结肠癌细胞HCT-8转染miR-7 inhibitor后迁移能力,与转染miR-7 inhibitor negative的阴性对照组及未转染的空白组成明显上升趋势(P≤0.05)。结肠癌细胞转染 miR-7 mimic后迁移能力,与转染miR-7 mimic negative的阴性对照组及未转染的空白组成下降趋势(P≤0.05)。
　　6. miR-7表达改变后结肠癌细胞的迁移相关蛋白MMP-2与MMP-9的表达发生相应的改变。结肠癌细胞转染miR-7 mimic后MMP-2和MMP-9的表达,与转染miR-7 mimic negative的阴性对照组及未转染的空白组成明显下降趋势。结肠癌细胞转染 miR-7 inhibitor后 MMP-2和 MMP-9的表达,与转染 miR-7 inhibitor negative的阴性对照组及未转染的空白组成明显上升趋势(P≤0.05)。
　　结论:
　　1.脂质体成功转染 miR-7 mimic及 miR-7 inhibitor入结肠癌细胞并调节miR-7的表达。
　　2. miR-7表达改变后结肠癌细胞的FAK蛋白呈负性表达。miR-7表达上调后FAK表达下降,miR-7表达下调后FAK表达上升,呈负相关。miR-7可通过靶向FAK的表达调节结肠癌细胞的生物活动。
　　3. miR-7能够抑制结肠癌细胞的增殖及迁移能力。miR-7上调后结肠癌细胞增殖及迁移能力下降,miR-7下调后结肠癌的增殖及迁移能力增加。
　　4. miR-7表达改变后结肠癌细胞的MMP-2/MMP-9蛋白呈负性表达。miR-7可以抑制细胞迁移相关蛋白的表达。

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中英文缩略词表

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 研究材料

2.1.2 主要设备

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要试剂液体的配制

2.2 实验方法

2.2.1细胞培养及传代

2.2.2细胞转染

2.2.3荧光显微镜检测转染效率

2.2.4 实时荧光定量RT-PCR

2.2.5 Western blot 检测

2.2.6 MTT实验

2.2.7 细胞划痕实验

2.2.8 统计学处理

第3章 结果

3.1 脂质体转染成功调节结肠癌细胞miR-7的表达

3.2 miR-7对FAK蛋白表达变化的影响

3.3 MTT检测miR-7对结肠癌细胞增殖能力的影响

3.4 划痕实验检测miR-7对结肠癌细胞迁移能力的影响

3.5 miR-7对结肠癌细胞迁移相关蛋白MMP-2/MMP-9的影响

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述