靶向人FAK和PLK1基因的RNA干扰表达质粒-阳离子脂质体-肝素抗肿瘤复合物

摘要

本发明属于肿瘤基因治疗领域，具体是要提供一种靶向人FAK和PLK1基因的RNA干扰质粒-脂质体-肝素抗肿瘤复合物。本发明RNA干扰表达载体能在体内表达针对FAK基因上由SEQID NO.1所示靶点的RNA干扰序列和针对PLK1基因上由SEQ ID NO.2所示靶点的RNA干扰序列。本发明所制备的FAK和PLK1双基因RNA干扰质粒能有效地抑制人肺癌细胞的生长并诱导其凋亡；体内的抑瘤实验也表明FAK和PLK1双基因RNA干扰质粒－脂质体－肝素复合物能够显著抑制多种肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存期。本发明产品功效明显，能减少给药量、提高患者的生活质量，因此具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤基因治疗领域，具体涉及靶向人FAK和PLK1基因的RNA干扰表达质粒-脂质体-肝素抗肿瘤复合物。

背景技术

目前肿瘤的基因治疗获得了蓬勃快速的发展，但是至今为止，仍然存在许多需要解决的问题。而其中急需解决的问题是：目前用于肿瘤基因治疗的基因太少，能抑制肿瘤生长的基因为数不多，急需提供更多可供利用的基因；另外，由于肿瘤的发生、发展、转移等过程是一个多基因参与、涉及多条信号通路的复杂网络系统，因此单个基因治疗或单一治疗方法往往疗效有限。因此，未来基因治疗发展的重点将在于挖掘并鉴定在临床上有治疗价值的基因，探索多个具有不同抗肿瘤作用机理的基因联合治疗以及将肿瘤基因治疗与化疗、放疗合用。

Focal-adhesion kiBase(FAK)基因是一个整合素家族成员基因，是一种定位于黏着斑的非受体型酪氨酸激酶，参与调控细胞的运动与增殖等，它可促进细胞向细胞外基质附着，在肿瘤发生、发展、转移、预后过程中扮演重要功能。FAK基因可以促进肿瘤细胞迁移，从而导致肿瘤扩散、转移，同时也影响肿瘤治疗的预后效果。大量研究发现FAK基因在多种肿瘤组织中较正常组织表达明显增高，在发生肿瘤转移和预后差的病人组织中检测到FAK基因表达水平显著上调，如结肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、口腔上皮癌、头颈部鳞状上皮癌、黑色素瘤、急性髓细胞样白血病、甲状腺癌等恶性肿瘤中表达增加，而且FAK基因表达水平上调直接与肿瘤的发生、发展、转移、预后相关，因此，FAK基因是肿瘤治疗潜在的理想靶标。

PLK1(polo like kinase 1)激酶属于高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，对于细胞周期调控具有重要作用，包括PLK1、PLK2、PLK3、PLK4共四个成员，而研究最为深入、最有治疗前景的靶标的是PLK1。PLK1在多种恶性肿瘤中过表达，是多种肿瘤诊断的潜在靶标，大量研究发现PLK1在肺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、黑色素瘤、胶质瘤、淋巴瘤等恶性肿瘤中异常高表达，并可以引起染色体分裂异常活跃，诱发正常细胞癌变，已被确认与许多肿瘤的发生、发展有关，同时也与肿瘤患者预后差正相关，是多种肿瘤治疗的理想靶标。

目前，RNA干扰已经广泛用于肿瘤治疗研究，但大多数是利用化学合成的siRNA对肿瘤进行治疗，而化学合成的siRNA治疗存在以下缺点：化学合成的siRNA用量大，使用成本高，产业化难度大；化学合成的siRNA在体内作用的稳定性差，时间短，每次使用时对操作人员的技术要求较高；多次输注对患者的生活质量也有不好的影响。同时从文献报导来看，单个基因的RNA干扰效果往往不是十分理想，因为肿瘤的发生、发展、转移、侵袭等是一个涉及多基因、多步骤复杂的过程，可能涉及的是多个基因、多条信号通路，所以针对多个靶点基因进行RNA干扰治疗可能是一个更好的选择，效果也有可能更好，同时将双基因甚至多基因的RNA干扰治疗与化疗、放疗合用在临床肿瘤治疗方面可能更有前景，但目前未见相关报道。另外，治疗基因的有效导入也一直是影响基因治疗效果的重要因素，在提高治疗基因的转入效率和增强靶向性等方面，目前虽然有众多研究，但是离找到能广泛普遍适用的方案还有极大的距离。仍然要根据不同的基因治疗方案进行不同的开发。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种能靶向FAK和PLK1双基因的RNA干扰表达载体。该RNA干扰表达载体能在体内表达针对FAK基因上由SEQ ID NO.1所示靶点的RNA干扰序列和针对PLK1基因上由SEQ ID NO.2所示靶点的RNA干扰序列。

其中，表达针对FAK基因上由SEQ ID NO.1所示靶点的RNA干扰序列的表达框架的正义链序列为SEQ ID NO.3所示，表达框架反义链序列为SEQ ID NO.4所示。

其中，表达针对PLK1基因上由SEQ ID NO.2所示靶点的RNA干扰序列的表达框架正义链序列为SEQ ID NO.5所示，表达框架反义链序列为SEQ ID NO.6所示。

其中，上述的表达载体为质粒。

其中，上述质粒的骨架为pGensil-2，多克隆位点部分有所区别，含有人的U6和H1启动子，分别用于启动FAK基因RNA干扰表达框架和PLK1基因RNA干扰表达框架。

进一步的，上述RNA干扰表达载体具有SEQ ID NO.7所示的序列。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述的RNA干扰表达载体的脂质体复合物。

其中，上述的脂质体为阳离子脂质体。

其中，上述阳离子脂质体是由摩尔比为1∶1的DOTAP和胆固醇(Chol)组成。

进一步的，脂质体复合物还含有肝素。优选的，上述阳离子脂质体复合物中阳离子脂质体、质粒DNA、肝素的重量配比为脂质体∶质粒DNA∶肝素＝25-30∶10∶1-1.5。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供上述RNA干扰表达载体或上述的脂质体复合物在制备抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤辅助药物组合物中的用途。

本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种抗肿瘤药物组合物或抗肿瘤辅助药物组合物，是由上述的RNA干扰表达载体或上述的脂质体复合物作为主要活性成分添加药学上可以接受的辅料制备而成的。

其中，上述抗肿瘤药物组合物还含有肿瘤化疗药物作为活性成分。

本发明所要解决的第五个技术问题是提供一种制备上述RNA干扰表达载体的方法，该方法包括以下步骤：

a、分别设计并合成能表达SEQ ID NO.1所示的FAK基因的RNA干扰序列的表达框架序列和SEQ ID NO.2所示的PLK1基因的RNA干扰序列的表达框架序列；

b、将a步骤所得表达框架序列转入目标表达载体，使表达框架序列能由启动子操作表达；扩增筛选即得。

本发明所要解决的第六个技术问题是提供一种制备上述脂质体复合物的方法，该方法包括以下步骤：

a、将DOTAP与胆固醇(Chol)按1∶1的摩尔比进行混合，制成DOTAP/Chol阳离子脂质体混悬液；

b、按脂质体∶RNA干扰表达载体∶肝素＝25～30∶10∶1～1.5(干物质的重量比)的比例准备原料，将脂质体溶液加入到RNA表达载体的溶液中，振荡2min，在4摄氏度下孵化，再加入肝素，在4摄氏度下再孵化2个小时，得到质粒DNA-阳离子脂质体-肝素复合物。

需要说明的是，以上生产和操作本发明公开的基因、重组载体和脂质体复合物的具体常规技术方法和设备是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的技术方案根据相应的操作手册完成。

本发明具有的有益效果在于：本发明靶向FAK和PLK1的双基因RNA干扰载体可以大大降低生产成本，具有更持久的体内作用时间；本发明靶向FAK和PLK1的双基因RNA干扰载体的脂质体复合物，可以更稳定地将shRNA表达载体导入到体内，对shRNA载体起到了保护和缓释作用，使其在体内的作用时间更持久，效果更好。而利用肝素修饰后可以有效降低复合物的电荷，从而降低脂质体的毒性，另外一些肿瘤细胞表面存在肝素受体，这样可将治疗基因靶向输送到肿瘤部位，提高治疗效果。并且本发明靶向FAK和PLK1的双基因RNA干扰载体的阳离子脂质体复合物具有被动靶向肿瘤血管内皮细胞的作用，而肿瘤血管内皮细胞是肿瘤细胞营养物质的主要来源，这样能使抗肿瘤作用更为显著，同时试验也表明其对肿瘤的治疗更具优势。另外，现有的肿瘤生物治疗产品均需要采用肿瘤内、腹腔内等给药方式，而本发明靶向FAK和PLK1的双基因RNA干扰载体及其脂质体复合物均能采用的静脉注射方式，并有显著的疗效，更适合进行临床使用，尤其难能可贵的是对非实体肿瘤或转移肿瘤是会有较好的疗效，为本领域当前的这一难题的解决提供了一种新的解决途径。同时，本发明FAK+PLK1双基因RNA干扰载体的阳离子脂质体复合物和化疗药物顺铂或放射治疗共同作为抗肿瘤综合治疗比各自单独使用明显具有更优的效果，能降低两者的使用量。本发明产品功效明显，毒副作用小，制备方法简单，能克服化疗药物、放射治疗毒副作用大、疗效难持久等缺陷，能大大减少给药量、减轻患者经济负担并提高患者的生活质量，具有很好的市场前景。

以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

附图说明

图1为；质粒pGenesil-2-hH1结构图。

图2为；质粒PG6-1结构图。

图3为；所构建的双基因RNA干扰重组质粒的酶切鉴定。

图4为；各组肿瘤细胞的凋亡情况。

图5为；各组动物的肿瘤重量。

图6为；各组动物的肿瘤体积。

具体实施方式

实施例一同时靶向FAK和PLK1双基因的shRNA表达质粒的构建

选择人的FAK基因上能够明显抑制该基因表达的siRNA靶点序列(SEQ ID NO.1)：5’-AACCACCTGGGCCAGTATTAT- 3’(human FAK：GenBank accession no：NM_153831)和人的PLK1基因上能够明显抑制该基因表达的siRNA靶点序列(SEQ ID NO.2)：5’-CCTTGATGAAGAAGATCAC-3’(human PLK1：GenBank accession no：NM_005030)。

表达双基因RNA干扰序列的shRNA质粒表达载体构建过程如下：

1、按如下结构设计并合成RNA干扰表达框架

表达框架结构：

(其中的Loop指连接序列)。

(1)FAK基因的RNA干扰靶序列为：

5’-AACCACCTGGGCCAGTATTAT-3’

合成以下FAK基因的RNA干扰表达框架：

正义链(SEQ ID NO.3)：

(设计有EcoRI酶切位点)

反义链(SEQ ID NO.4)：

5’-AGCTTGAATTCAAAAAACCACCTGGGCCAGTATTATCGTCTTGAAATAATACTGGCCCAGGTGGCG-3’

(2)PLk1基因的RNA干扰靶序列：

5’-CCTTGATGAAGAAGATCAC-3’

台成以下PLK1基因的RNA干扰表达框架：

正义链(SEQ ID NO.5)：

(设计有Sac I酶切位点)

反义链(SEQ ID NO.6)：

5’-AGCTTGAGCTCAAAAAACCTTGATGAAGAAGATCACCGTCTTGAAGTGATCTTCTTCATCAAGGCG-3’

2、用上述合成的双链构建pGen-(FAK+PLK1)载体

1、单链目的基因片段的退火连接：分别取上述合成的FAK和PLK1基因的单链RNA干扰表达框架目的片段进行退火连接分别得到双链的FAK和PLK1的RNA干扰表达框架。

2、将质粒pGenesil-2-hH1(其结构见图1)和PG6-1(其结构见图2)分别进行Bam HI+Hind III双酶切，并凝胶回收大片段。

3、将双链的FAK干扰引物序列片段与线性化的PG6-1连接，得到PG6-1-F质粒；将双链的PLK1干扰引物序列片段与线性化的pGenesil-2-hH1连接，得到pGenesil-2-hH1-P质粒。

4、将PG6-1-F质粒和pGenesil-2-hH1-P质粒分别用Eeo R I和Sac I进行酶切鉴定，切出400bp条带，表明连接成功。

5、将PG6-1-F质粒和pGenesil-2-hH1-P质粒都用Sac I+Xba I进行双酶切，分别回收大片段和小片段(160bp)。

6、将所回收的大片段与小片段进行连接，得到PG6-hU6-F+4hH1-P质粒(简称为PGen-FAK+PLK1)。

7、利用Bam HI酶切鉴定PGen-(FAK+PLK1)质粒，酶切出400bp条带，并测序，与预期序列一致，表明构建成功(酶切结果见图3)。

所构建的PGen-(FAK+PLK1)载体全长4115bp，全序列如SEQ ID NO.7所示(反义链)。

其中：所插入的siRNA表达框架为：

FAK基因的siRNA表达框架：

PLK1基因的siRNA表达框架：

实施例二、质粒DNA-阳离子脂质体-肝素复合物的制备

1、DOTAP-Chol阳离子脂质体的制备

将阳离子脂质体DOTAP与中性成分胆固醇(Chol)按1∶1的摩尔比进行混合，并将混合物用HPLC级的氯仿进行溶解，并置于旋转蒸发仪上40℃下旋蒸1小时后成膜，真空干燥过夜。所成的膜取出后溶解于5％的葡萄糖溶液中，然后在55℃水浴条件下震荡1小时，将混合物转到一个试管中，并通过220nm聚碳酸酯膜挤压3次，最后将混合物溶解在5％的葡萄糖溶液中，得到5mg/ml的DOTAP-Chol阳离子脂质体混悬液。

2、制备pGen-(FAK+PLK1)质粒DNA

利用50L的细菌高密度发酵罐和质粒DNA纯化仪-AKTA Pliot(美国通用电器公司)中试生产高纯度的实施例一中构建的pGen-(FAK+PLK1)质粒DNA，所纯化的pGen-(FAK+PLK1)质粒DNA符合国家药物质粒DNA生产标准，符合体内外实验要求。

3、质粒DNA/阳离子脂质体/肝素复合物的制备

按脂质体∶DNA∶肝素＝30∶10∶1(W/W)的比例(干物质的重量比)准备原料以进行后续操作。按照脂质体∶DNA＝30∶10的比例(质量比)将脂质体溶液加入到pGen-(FAK+PLK1)溶液中，之后立刻涡流振荡2min，在4摄氏度下孵化1h，再按上述比例加入肝素，在4摄氏度下再孵化2个小时，得到质粒DNA-阳离子脂质体-肝素复合物。

试验例一  本发明pGen-(FAK+PLK1)质粒的体外抗肿瘤实验

本发明使用了人肝癌细胞株HepG2、乳腺癌细胞株MD-MBA-435s、结肠癌细胞株SW480，以下是HepG2细胞株的详细实验结果，MD-MBA-435s和SW480也得到趋势相同的结果。

pGen-(FAK+PLK1)质粒诱导人肝癌细胞的凋亡。

实验按如下分组进行(6孔板)：

1、空白对照(KB)；无血清培养基

2、无关序列+Liposome(shRNA-HK)：2μg pGen-HK+5μg Liposome；

3、pGen-FAK+Liposome(shRNA-FAK)：2μg pGen-FAK+5μg Liposome；

4、pGen-PLK1+Liposome(shRNA-PLK1)：2μg pGen-PLK1+5μg Liposome；

5、pGen-(FAK+PLK1)+liposome(shRNA-FAK+PLK1)：2μg pGen-(FAK+PLK1)+5μgLiposome。

实验过程如下，在转染前24小时将细胞接种在6孔板(2×10⁵细胞/孔)，转染时细胞密度为60-70％，在转染前1-2小时将6孔板中的培养基更换为无血清、无抗生素的DMEM培养基，按以上分组和各组所加的剂量进行实验，具体的操作过程见质粒DNA的操作流程，转染后6小时将孔中的培养基换成DMEM+10％胎牛血清的完全培养基进行培养。

实验结果如下：转染48小时后，将6孔板置于倒置显微镜下观察，发现空白对照组和无关序列对照组HepG2细胞生长良好，pGen-FAK质粒或pGen-PLK1转染组细胞有分别有22％和35％的细胞死亡，而pGen-(FAK+PLK1)质粒转染组40-55％的细胞死亡，表现出更强的抑制肿瘤细胞生长并诱导肿瘤细胞凋亡作用(结果见图4)。

转染48小时后，将各孔中的培养基轻轻吸掉，每孔加入500μl的Hoechst 33342染色液，然后置于倒置荧光显微镜下观察，实验发现pGen-(FAK+PLK1)质粒转染能够明显诱导HepG2细胞产生凋亡，Hoechst 33342染色可见很多核固缩的凋亡小体，而pGen-FAK和pGen-PLK1质粒转染组只有部分细胞产生凋亡，故pGen-(FAK+PLK1)质粒具有最强的诱导肿瘤细胞凋亡作用。

试验例二  pGen-(FAK+PLK1)质粒-阳离子脂质体-肝素复合物体内抗肝癌实验

为了研究pGen-(FAK+PLK1)质粒-阳离子脂质体-肝素复合物在体内的抗肿瘤效应，在BALB/c裸鼠(6-8周龄，雌性)皮下建立了人肝癌HepG2的移植瘤模型。简言之，将体外培养的人肝癌细胞HepG2用胰酶消化，并定容在无血清、无抗生素的DMEM培养基中，调整的细胞浓度为2×10⁷cells/ml，在每只裸鼠的右侧背腹部皮下接种2×10⁶cells(0.1ml)，细胞接种5-7天后可以扪及到肿瘤，开始按以下进行随机分组治疗(每组5只)：

A)空白对照组：5％的葡萄糖溶液；

B)无关序列组对照组(shRNA-HK)：pGen-HK-脂质体-肝素复合物置于5％的葡萄糖溶液中；

C)pGen-FAK治疗组(shRNA-FAK)：pGen-FAK-脂质体-肝素复合物置于5％的葡萄糖溶液中；

D)pGen-PLK1治疗组(shRNA-PLK1)：pGen-PLK1-脂质体-肝素复合物置于5％的葡萄糖溶液中；

E)pGen-(FAK+PLK1)治疗组(shRNA-F+P)：pGen-(FAK+PLK1)-脂质体-肝素复合物置于5％的葡萄糖溶液中。

采取尾静脉注射方式进行治疗，将所制备的质粒DNA-阳离子脂质体-肝素复合物按治疗剂量稀释在葡萄糖溶液中，并调整使得葡萄糖终浓度为5％。每只小鼠每次给的质粒DNA为5μg，每次注射体积为200μl，每隔一天进行治疗，共治疗10次，每3天测量1次肿瘤体积(结果见图6)，肿瘤体积按以下方法计算：体积(mm³)＝0.52×长(length)×宽²(width²)。肿瘤生长抑制用方差分析，P＜0.05则认为有统计学意义。处死动物取肿瘤组织时将各组肿瘤进行称重，结果如图5所示。

实验各组都没有观察到明显的毒副作用，观察27天将小鼠全部处死。从以上的各组动物的肿瘤体积曲线、肿瘤重量情况分析发现pGen-(FAK+PLK1)双基因RNA干扰治疗组的抗肿瘤作用最强，与对照组相比抑瘤率达到76％，而pGen-FAK和pGen-PLK1组也具有较强的抗肿瘤作用，抑瘤率分别达到48.1％和61.5％。由以上结果可以看出pGen-(FAK+PLK1)双基因RNA干扰治疗组比任何单一基因RNA干扰治疗组都具有更强的治疗人肝癌的作用。

以上结果表明，在人肝癌模型中pGen-(FAK+PLK1)-阳离子脂质体-肝素复合物能有效抑制肿瘤的生长，而且，我们使用的是一个很低的治疗剂量。这提示我们，在以后的临床应用中，可以大大降低pGen-(FAK+PLK1)-阳离子脂质体-肝素复合物的使用剂量，提高治疗效果，同时降低毒副作用。

试验例三  本发明产品pGen-(FAK+PLK1)与顺铂(cisplatin)联用抗肿瘤试验

为了研究pGen-(FAK+PLK1)-阳离子脂质体-肝素复合物加化疗的抗肝癌效应，我们如前所述在BALB/c裸鼠(6-8周龄，雌性)皮下建立了人肝癌移植瘤模型，于细胞接种5-7天后可扪及到肿瘤，开始按以下进行随机分组治疗(每组5只)：

1、空白对照组：5％的葡萄糖溶液；

2、无关序列对照组(shRNA-HK)：pGen-HK-脂质体-肝素复合物置于5％的葡萄糖溶液中；

3、pGen-(FAK+PLK1)干扰治疗组：pGen-(FAK+PLK1)-脂质体-肝素复合物置于5％的葡萄糖溶液中；

4、化疗组：0.1mg顺铂(DDP)/只；

5、无关序列加化疗组：pGen-HK-脂质体-肝素复合物置于5％的葡萄糖溶液中，化疗药物顺铂DDP的使用如下所述；

6、pGen-(FAK+PLK1)RNA干扰加化疗组：pGen-(FAK+PLK1)-脂质体-肝素复合物置于5％的葡萄糖溶液中，化疗药物顺铂DDP的使用如下所述。

质粒DNA-脂质体-肝素复合物采取尾静脉注射方式进行体内给药，每只小鼠每次给的质粒DNA为5礸，每次注射200祃体积，每隔一天进行治疗，共治疗12次，每3天测量1次肿瘤体积。

DDP采取腹腔给药方式进行治疗，在第一次RNA干扰治疗后2天开始进行化疗，每周两次，连续2周，注射剂量为5mg/kg体重，每只小鼠每次注射0.1mg的DDP。最后处死动物取肿瘤组织，并对各组肿瘤进行称重。分析结果发现pGen-(FAK+PLK1)-脂质体-肝素复合物治疗加化疗药物——顺铂治疗组比这两种药物单用具有更强的抗肿瘤效果，总抑瘤率达到88.7％，而单纯的pGen-(FAK+PLK1)治疗组(抑瘤率达到76％)和顺铂治疗组(抑瘤率达到42.3％)，由此可见，双基因的RNA干扰治疗可以增强肿瘤对化疗药物的敏感性。

以上是对人肝癌治疗的结果，对人的卵巢癌、结肠癌治疗也取得了类似的结果，表明这种FAK和PLK1同时双基因RNA干扰治疗以及与化疗合用对多种肿瘤治疗效果显著。FAK基因在肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、口腔上皮癌、头颈部鳞状上皮癌、黑色素瘤、急性髓细胞样白血病、甲状腺癌等恶性肿瘤中异常高表达；PLK1基因在肺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、黑色素瘤、胶质瘤、淋巴瘤等恶性肿瘤中异常高表达，本申请通过对肝癌、卵巢癌、结肠癌的治疗结果可以推理该治疗药物和治疗方式对上述其他肿瘤也会有很好的治疗效果。

以上的较优的具体实施方式是对本发明作进一步的举例说明，但并非对本发明范围的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种变型或改进。比如由本领域常识可知，本发明中的表达框架结构中Loop(连接序列)的长度和组成可以有一定的变化。而若有不同的要求，本发明的抗肿瘤药物组合物和抗肿瘤辅助药物组合物的用量和使用方式可以在一个较大范围内变动。本领域技术人员可以根据一些已知的因素，诸如疾病的种类，病情严重程度，病人体重，剂型，所选用药途径等很容易地加以确定。只要不脱离本发明的基本思想，这些变动均在本发明的精神及所附上的权利要求书定义的范围之内。

                SEQUENCE LISTING

<110>四川大学

<120>靶向人FAK和PLK1基因的RNA干扰表达质粒-阳离子脂质体-肝素抗肿瘤复合物

<130>A080291k

<160>7

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>1

aaccacctgg gccagtatta t                                              21

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>2

ccttgatgaa gaagatcac                                                 19

<210>3

<211>66

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>3

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<210>4

<211>66

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>4

agcttgaatt caaaaaacca cctgggccag tattatcgtc ttgaaataat actggcccag    60

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<210>5

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<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>5

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<212>DNA

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<220>

<223>artificial

<400>6

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<210>7

<211>4115

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>artificial

<400>7

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cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt    120

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aattcaaaaa accacctggg ccagtattat cgtcttgaaa taatactggc ccaggtggcg    720

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aaaccttgat gaagaagatc accgtcttga agtgatcttc ttcatcaagg cggatccgag    1140

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ttcccagaac acatagcgac atgcaaatat gaattcgggc cgcctgcagc actacgtgaa    1260

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