DNMT1基因干扰对胰腺癌BxPC-3细胞miR-148a表达、CpG岛甲基化水平及细胞增殖的影响

摘要

目的:
　　探讨DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因干扰对胰腺癌BxPC-3细胞miR-148a表达、CpG岛甲基化水平及细胞增殖的影响。
　　方法:
　　将胰腺癌BxPC-3细胞接种于DMEM培养基,置于37℃、5％ CO2孵箱中进行培养。实验分3组:转染空白脂质体至胰腺癌BxPC-3细胞作为空白对照组,转染阴性siRNA作为阴性对照组,转染DNMT1 siRNA作为实验组。转染48 h后,采用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)法检测BxPC-3细胞中DNMT1 mRNA相对表达量;Western blot法检测DNMT1蛋白表达量;荧光实时定量PCR法检测miR-148a基因表达量;甲基化特异性PCR(MSP)法分析miR-148a基因启动子CpG岛甲基化水平;四甲基偶氮唑盐比色分析法(MTT)检测BxPC-3细胞体外增殖活力。
　　结果:
　　(1)实验组、阴性对照组和空白对照组BxPC-3细胞中DNMT1 mRNA相对表达量分别为(0.41±0.06)、(0.99±0.06)和(1.00±0.00);实验组DNMT1 mRNA及蛋白表达量均显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01);(2)实验组、阴性对照组和空白对照组BxPC-3细胞中miR-148a相对表达量分别为(3.23±0.17)、(1.03±0.67)和(1.00±0.00);实验组miR-148a相对表达量显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.01);(3)空白对照组和阴性对照组BxPC-3细胞中 miR-148a基因启动子 CpG岛均为甲基化阳性,而实验组miR-148a基因启动子CpG岛为甲基化阴性。(4)转染后48~120h,实验组细胞体外增殖速度较空白对照组和阴性对照组明显减慢(P<0.05);在转染后的48 h、72 h、96 h和120 h不同时间点,实验组的细胞增殖抑制率分别为12.72%、22.78%、14.44%和18.18%。
　　结论:
　　DNMT1基因干扰后,胰腺癌BxPC-3细胞DNMT1表达水平下调,导致miR-148a基因启动子CpG岛发生去甲基化,从而使miR-148a基因表达水平上调,并抑制癌细胞增殖;在胰腺癌BxPC-3细胞中,miR-148a的表达受DNA甲基化调控;DNMT1和miR-148a可作为胰腺癌基因治疗的有效靶点。

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缩略词对照表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 试剂与材料

2.1.1主要试剂列表

2.1.2 细胞

2.1.3主要仪器列表：

2.2 实验方法及操作流程

2.2.1 siRNA序列设计及合成

2.2.2 BxPC-3细胞培养及实验分组

2.2.3 BxPC-3细胞的转染

2.2.4 转染后BxPC-3细胞的RNA提取与鉴定

2.2.5 荧光实时定量PCR法检测转染后各组细胞DNMT1 mRNA表达

2.2.6 Western blot检测转染后各组细胞DNMT1蛋白表达

2.2.7 荧光实时定量PCR法检测转染后各组细胞miR-148a表达

2.2.8 甲基化特异性PCR法检测转染后各组细胞miR-148a基因启动子CpG岛甲基化水平

2.2.9 MTT法检测细胞体外增殖活力

2.3 统计分析

第3章 结果

3.1 各组样本总RNA、DNA提取物质量鉴定

3.1.1 总RNA质量鉴定

3.1.2 总DNA质量鉴定

3.2 DNMT1基因干扰对胰腺癌BxPC-3细胞DNMT1 mRNA和蛋白表达的影响

3.2.1 荧光实时定量PCR法检测转染后各组细胞DNMTl mRNA表达量

3.2.2 Western Blot检测转染后各组细胞DNMT1蛋白表达量

3.3 DNMT1基因干扰对胰腺癌BxPC-3细胞miR-148a表达水平的影响

3.4 DNMT1基因干扰对胰腺癌BxPC-3细胞miR-148a基因启动子CpG岛甲基化状态的影响

3.5 DNMT1基因干扰对胰腺癌BxPC-3细胞体外增殖活力的影响

第4章 讨论

第5章 结论

第6章 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述