调节Notch-1信号系统对高糖诱导心肌细胞损伤的保护作用及机制

摘要

目的:
　　1.观察高糖对H9c2心肌细胞增殖、凋亡及纤维化的影响。
　　2.观察以Notch-1为靶点干预对高糖诱导的H9c2心肌细胞增殖、凋亡及纤维化的影响。
　　3.探讨过表达Notch-1抑制高糖诱导的H9c2心肌细胞凋亡及纤维化的机制。方法:
　　1.体外低糖正常培养H9c2细胞,再分别运用高糖、γ分泌肽酶抑制剂(DAPT)和Notch-1过表达慢病毒进行干预。
　　2.实验分六组:①Control组:正常对照组,用5.5mmol/L低糖培养基培养H9c2细胞;②Mannitol组:甘露醇高渗对照组,用含33mmol/L甘露醇的培养基培养H9c2细胞;③High glucose组:阳性对照组,用含33mmol/L葡萄糖的培养基培养H9c2细胞;④DAPT组:用Notch-1特异性阻断剂γ分泌肽酶抑制剂(DAPT)干预H9c2细胞;⑤Notch-1组:感染Notch-1过表达病毒组;⑥GFP组:感染空载体慢病毒组。
　　3.DAPT干预48h,慢病毒感染72h后,用CCK-8试剂盒检测各组H9c2细胞的增殖抑制率;应用Annexin V-FITC/PI双染色后流式细胞仪测各组H9c2细胞凋亡率并比较;同时应用qRT-PCR法分别测定各组H9c2细胞PI3K、AKT mRNA的表达;Western blot法测定各组H9c2细胞Notch-1、p-PI3K/p-AKT、Bax、Bcl-2、TGF-β1、collagen I蛋白的表达并比较。
　　结果:
　　1.成功构建Notch-1过表达慢病毒载体,病毒滴度为2×108TU/ml;病毒感染72h,MOI=40时,病毒转染效率最强。
　　2.CCK8试剂盒法测定各组H9c2心肌细胞增殖抑制率,结果显示:高糖可使H9c2心肌细胞增殖抑制率增高,过表达Notch-1可使H9c2心肌细胞增殖抑制率下降,DAPT干预后H9c2心肌细胞增殖抑制率进一步增高,差异有统计学意义(P<0.01)。
　　3.Western Blot法检测各组H9c2心肌细胞Bax、Bcl-2表达,结果显示:高糖可使Bax/Bcl-2比值增高,过表达Notch-1可使Bax/Bcl-2比值减小,DAPT干预后Bax/Bcl-2比值进一步增高,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　4.应用Annexin V-FITC/PI双染色后流式细胞仪测各组H9c2心肌细胞凋亡率并比较,结果显示:高糖可使H9c2心肌细胞凋亡率增高,过表达Notch-1可使H9c2心肌细胞凋亡率减小,DAPT干预后H9c2心肌细胞凋亡率进一步增高,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　5.Western blot法测定各组H9c2心肌细胞中TGF-β1、collagen I蛋白表达,结果显示:高糖可使TGF-β1和collagen I表达上调,过表达Notch-1使TGF-β1和collagen I表达下调,DAPT干预后可使TGF-β1和collagen I上调达最高值,差异有统计学意义(P<0.01)。
　　6.qRT-PCR法测定各组H9c2心肌细胞中PI3K/AKT mRNA含量并比较,结果显示:高糖可使PI3K/AKT mRNA表达下调,过表达Notch-1可使PI3K/AKT mRNA表达上调,DAPT干预后可使H9c2心肌细胞PI3K/AKT mRNA表达进一步下降,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　7.Western blot法测定各组H9c2心肌细胞Notch-1、p-PI3K/p-AKT蛋白的表达,结果显示:高糖可使Notch-1、p-PI3K/p-AKT蛋白表达下调,过表达Notch-1可使p-PI3K/p-AKT蛋白表达上调,DAPT干预后p-PI3K/p-AKT蛋白表达进一步减少,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论:
　　⑴成功构建了Notch-1过表达的慢病毒载体,并高效感染H9c2细胞。
　　⑵高糖可诱导H9c2心肌细胞发生凋亡及纤维化反应;过表达Notch-1能够抑制高糖诱导的H9c2心肌细胞的凋亡和纤维化反应。
　　⑶过表达Notch-1能够激活PI3K/AKT通路,使AKT磷酸化并调控下游Bcl-2家族蛋白的表达,还可以抑制TGF-β1的表达,进而使collagen I纤维化因子的表达下调,并可能通过这种效应来减轻高糖诱导的H9c2细胞的凋亡和纤维化反应;从而提示激活PI3K/AKT及其两者之间的整合作用可能是Notch-1减轻心肌细胞凋亡和纤维化反应的主要途径。

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中英文缩略词表

第1章 引言

1.1 Notch信号通路简单概述以及在心脏中的作用

1.2 PI3K/AKT信号通路与心肌保护作用

1.3 Notch-1信号系统与PI3K/AKT通路相互整合参与心肌保护

1.4 Notch-1信号系统在心肌细胞纤维化中的作用

1.5 以PI3K/AKT为切入点研究Notch-1信号系统对心肌损伤的保护作用及机制

第2章 材料与方法

2.1实验材料

2.2 实验方法

2.3 统计学分析

第3章 结果

3.1 H9c2细胞的生长特点

3.2 不同浓度DAPT对H9c2心肌细胞增殖的影响

3.4 Western blot法测定各组细胞Notch-1蛋白的表达

3.5 Notch-1对心肌细胞增殖的影响:CCK-8试剂盒检测各组H9c2细胞的增殖抑制率

3.6 Notch-1对心肌细胞凋亡的影响：

3.7 Notch-1对心肌纤维化反应的影响：Western blot法测定各组H9c2细胞中TGF-β1、collagen I蛋白表达

3.9 Western blot法测定各组细胞p-PI3K/p-AKT蛋白的表达

第4章 讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

综述Notch-1信号系统在心血管系统的研究进展