扩张型心肌病的分子遗传学机制及环境因素研究

摘要

研究背景:
　　扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy,DCM)是临床上一类以单侧或双侧心腔扩大和心室收缩功能障碍为主要特征的常见心肌病。既往流行病学调查DCM患病率为36.5/10万,近年来具有上升趋势。进行性心力衰竭和各种形式室性心律失常是DCM常见严重合并症,猝死风险高,因而引起研究人员广泛关注。
　　DCM多数情况下散发存在,部分可呈现家族性发病趋势,遗传因素在DCM发病中具有主导地位。目前国内外对DCM家系的大量遗传学研究已发现大约30％~50%的DCM具有显著的遗传基础,涉及近50个基因的相关变异。这些基因主要编码肌小节蛋白、细胞骨架蛋白、核膜层蛋白等,如TTN、MYH7、TNNT2和LMNA等。近来有文献报道与致心律失常性右室心肌病相关的编码桥粒蛋白基因如DSP、DSG2、PKP2,以及一些离子通道基因如ABCC9、SCN5A,也与DCM发病有关,具有高度遗传异质性。鉴于DCM患者易合并各种形式心律失常,甚至出现恶性心律失常如室性心动过速(Ventricular tachycardia,VT)或心室颤动(Ventricular fibrillation,VF)而导致猝死,对DCM发生心律失常易感性的分子遗传学机制进行深入研究具有重要意义。
　　DCM发病呈现男性多于女性的性别差异,然而这种差异产生的原因尚不清楚。性激素或环境激素干扰物是否是DCM发病的关键因素还有待研究。双酚A(bisphenol A,BPA)是目前公认的一类环境激素干扰化合物,广泛用于制作聚碳酸酯、环氧树脂等,已成为世界上产量最高的化学物质之一,无时无刻不存在于人类生产生活环境中。自从研究人员发现BPA可从塑料制品渗出通过饮食进入小鼠体内并致畸以来,BPA对人体健康的危害不容忽视。既往研究显示人体持续或高水平暴露于BPA环境可引起一些激素敏感性疾病,如生殖系统毒性、性早熟、不明原因自然流产、乳腺癌、前列腺癌甚至导致脑损害等。近年来一些基于人群的流行病学调查数据显示BPA与心血管疾病及其危险因素有着密切的联系,且基于动物和细胞水平的研究发现长期BPA暴露可影响小鼠的心脏结构和功能。然而,BPA与DCM发病的相关性迄今未见报道。
　　第一部分:扩张型心肌病并室性心动过速患者的分子遗传学机制研究
　　目的:
　　本研究通过候选基因检测的方式,首次探索钾通道基因与DCM并VT的分子遗传关联性,同时筛查DCM已知致病基因及离子通道基因新突变位点,并进一步从分子生物水平对突变基因进行功能分析,以揭示突变位点对其所编码蛋白功能的影响,深入探索DCM并VT的分子遗传学发病机制。同时结合突变携带者的病历资料,探讨候选基因检测对临床诊治的潜在指导意义。
　　方法:
　　1.临床资料收集:经医院伦理委员会批准,并获得患者知情同意,收集在我院心血管内科住院且诊断为DCM并VT的患者临床资料。DCM的诊断标准参照2006年AHA发布的心肌病当代定义和分类,以及2007年中国心肌病诊断与治疗建议工作组制定的DCM诊治建议。根据2006年ACC/AHA/ESC室性心律失常指南中VT的诊断标准,所有入选患者均需至少采集到一次VT发作时的心电图记录;
　　2.候选基因筛查:采集所有入选患者的外周静脉血2~5ml,提取DNA保存于-80℃冰箱。通过候选基因筛查方式,利用DNA直接测序法,对已知DCM致病基因和候选钾通道基因的全部外显子以及外显子-内含子交界区进行筛查,包括LMNA、MYH7、TNNT2、TNNI3、PKP2、DSP、DSG2、SCN5A和KCNQ1、KCNE1、KCNE2、KCNH2,以期发现致病基因新突变位点;对照组为400例来自相同种族但无血缘关系的健康个体以及70例不伴VT的DCM患者;
　　3.体外突变诱导及细胞转染:在野生型质粒的基础上,采用体外定点突变诱导技术构建突变质粒。根据突变位点设计诱导突变引物,突变诱导后通过DNA测序验证。通过脂质体介导成功转染突变型或野生型质粒,至人胚肾293细胞(HEK293)进行表达;
　　4.细胞膜片钳电生理分析:应用全细胞膜片钳技术对转染野生型或突变型质粒的 HEK293细胞的相应离子通道功能进行检测并分析其电生理特征。在室温记录所有相关电生理参数如电流密度、峰值以及激活曲线等。采用Fitmaster、SigmaPlot、OriginPro7.5等软件对数据进行分析、绘图;
　　5.免疫荧光共聚焦检测:采用细胞免疫荧光共聚焦检测技术观察突变型与野生型通道蛋白在细胞内的分布情况;
　　6.蛋白印迹(Western Blot)分析:通过提取细胞膜蛋白与浆蛋白,进行Western Blot分析转染野生型与R397Q突变型质粒的细胞KCNQ1通道蛋白表达水平;
　　7.数据处理及统计学分析:所有获取数据均采用SPSS18.0软件包进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组比较采用t检验,多组比较采用ANOVA检验。结果以P<0.05具有统计学意义。
　　结果:
　　1.本研究共纳入符合条件的DCM并VT患者10例,其中男性7例,女性3例,年龄16~77岁,平均年龄48.7±20.4岁。其中2例患者合并右束支传导阻滞,1例合并左束支传导阻滞,超声心动图结果显示左室舒张末径53~75mm,左室收缩末径40~67mm,左室射血分数22%~45%。
　　2.通过对候选基因编码区的全部外显子以及内含子-外显子结合区进行测序并与400例正常对照以及70例不伴VT的DCM患者进行比较,共发现3个基因新突变位点,分别为KCNQ1-p.R397Q、DSG2-p.R824G和SCN5A-p.V1604M突变。KCNQ1-p.R397Q突变:KCNQ1基因杂合子错义突变,第1190位核苷酸由G变为A,即c.1190G>A,从而导致第397位氨基酸由精氨酸变为谷氨酰胺。KCNQ1-p.R397Q突变存在于一位60岁男性DCM并VT患者。该患者入院心电图QT正常,经射频消融术及口服胺碘酮治疗后VT复发,随后再次行射频消融术并植入ICD,目前随访患者情况良好。SCN5A-p.V1604M突变:SCN5A-p.V1604M突变:SCN5A基因杂合子错义突变,第4810位核苷酸由G变为A,即c.4810G>A,从而导致第1604位氨基酸由缬氨酸变为蛋氨酸。该突变存在于一位61岁男性DCM并VT患者。该患者主要表现为胸闷气逼症状。10年前曾在外院经超声心动图诊断DCM。入我院时心电图提示完全性右束支传导阻滞,心房颤动;24小时动态心电图提示短阵VT。目前该患者已失访,病情进展情况未知。DSG2-p.R824G突变:DSG2基因杂合子错义突变,第2470位核苷酸由C变为G,即c.2470C>G,从而导致第824位的精氨酸被甘氨酸替代。DSG2-p.R824G突变存在于一位65岁男性DCM并VT患者,临床表现为心力衰竭和晕厥,表型严重但拒绝行ICD或CRTD植入术,带药出院半年后随访得知在家中猝死。本研究发现了5个单核苷酸多态性位点( SNP),分别为KCNQ1-p.I145I、DSG2-p.R773K、DSG2-p.T835T、MYH7-p.I989I以及PKP2-p.P273P。其中 DSG2-p.R773K、DSG2-p.T835T和PKP2-p.P273P为新发SNP。
　　3.全细胞膜片钳检测显示R397Q突变通道与野生型相比,Iks值在电压为-20~80mv时明显降低,提示钾通道功能降低;然而R397Q突变型与野生型的稳态激活曲线以及电压依赖失活常数均无显著性差异。与野生型相比,R397Q突变并不影响半数激活电压以及斜率。
　　4.免疫荧光共聚焦结果检测提示与野生型相比,转染R397Q突变质粒的细胞上,红色免疫荧光几乎全部被局限在细胞浆内,而未能到达细胞膜,导致KCNQ1蛋白在细胞膜上的定位明显下降;进一步行Western Blot分析发现,与野生型相比,R397Q突变型KCNQ1蛋白在细胞膜上表达量明显减少(P<0.01)。
　　结论:
　　1.本研究首次揭示KCNQ1基因是DCM并VT致病基因,进一步通道电生理分析显示,KCNQ1基因R397Q突变可通过“功能减退”导致DCM并VT的发生。KCNQ1通道蛋白膜定位表达下降以及转运缺陷均有可能参与了通道“功能减退”的病理机制。
　　2.在DCM并VT患者中检测到SCN5A基因新突变位点V1604M以及DSG2基因新突变位点R834G;提示DCM患者VT致病基因的异质性。
　　3.本研究检测到5个SNPs,分别为KCNQ1-p.I145I、DSG2-p.R773K、DSG2-p.T835T、MYH7-p.I989I以及PKP2-p.P273P。其中DSG2-p.R773K、DSG2-p.T835T和PKP2-p.P273P为新报道SNP。据他人结果报道推测KCNQ1-p.I145I多态性可能与DCM患者发生VT易感性有关。
　　4.携带KCNQ1-p.R397Q突变患者经射频消融术并服用胺碘酮后仍反复发作VT,说明携带基因突变的患者射频消融和药物治疗效果均欠佳,需要ICD置入治疗,提示基因筛查对临床治疗的潜在指导意义。
　　5.DCM不仅是心脏结构疾病,也是与离子通道相关的电生理疾病。本研究成果将为离子通道心肌病新概念的提出提供了坚实的理论支持依据,深入研究离子通道在DCM发病中的机制,将为寻找DCM治疗新靶点提供科学基础和理论依据。
　　第二部分:环境内分泌干扰化合物双酚A与扩张型心肌病的相关性探讨
　　目的:
　　检测血清BPA水平以及性激素相关指标在扩张型心肌病病例组和健康对照组中的差异,探索血清BPA水平对DCM发病的影响,并分析BPA与性激素相关指标的关系。
　　方法:
　　1.通过采用1:1匹配病例-对照研究的方法,纳入在2012年3月至2013年6月期间在本院心血管内科住院并诊断为DCM的患者作为病例组。同期在本院的体检中心根据性别年龄匹配原则选取的健康人群作为对照组。排除入组前3个月内曾接受激素治疗者外,所有入选研究对象均签署知情同意书,并对其临床资料坚持严格保密原则。
　　2.所有研究对象均于入院次日或体检当日清晨7:00至10:00采集空腹静脉血6ml,当天分离血清并保存于-80℃低温冰箱待集中测定血清BPA水平以及性激素相关指标包括雌二醇(E2)、睾酮(T)、性激素结合蛋白(SHBG)、雌激素受体α(ERα)、雌激素受体β(ERβ)。根据T值和SHBG值,利用公式计算游离雄激素指数(free androgen index)FAI值,FAI=T×100/SHBG。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定上述指标,BPA ELISA检测试剂盒由日本IBL公司提供,其余ELISA检测试剂盒由武汉优尔生科技股份有限公司提供。严格按照试剂盒说明书要求采集并保存血清标本,根据其提供的操作步骤及要求准备试剂及控制反应条件,用酶标仪测量标本光密度值(OD值)。根据标准品浓度和OD值绘制标准曲线,然后用样品OD值计算出样品浓度值。
　　3.研究数据采用SPSS18.0软件包进行处理并分析。所有计量资料以均数±标准差(x±s)表示,计数资料采用百分比表示;呈正态分布数据两组间比较采用t检验,非正态分布数据组间比较采用秩和检验;控制各项混杂因素后,采用线性回归方法分析血清BPA水平与性激素各项指标的相关性。结果以P<0.05具有统计学意义。
　　结果:
　　1.共纳入符合标准的DCM病例88例以及健康对照88例。其中DCM组男性59例,女性29例,男女发病比为2.0:1。DCM组平均年龄是(59.6±13.2)岁,对照组平均年龄是(59.0±12.7)岁。两组在性别年龄比较上无统计学差异(P>0.05)。
　　2.血清BPA检测结果:DCM病例组和健康对照组的血清BPA水平分别为(6.9±2.7)ng/ml,(3.8±1.9)ng/ml,两组比较具有显著统计学差异(P<0.001);根据性别不同,将研究对象分为男性DCM组与男性健康对照组、女性DCM组与女性健康对照组分别进行比较,结果分别为(7.0±2.9)ng/ml vs.(3.9±2.0)ng/ml和(6.5±2.2)ng/ml vs.(3.8±1.8)ng/ml,组间比较均具有显著统计学差异(P<0.001)。
　　3.性激素相关指标检测结果:DCM病例组和健康对照组的血清 T水平、SHBG水平以及 FAI值均存在统计学差异,其结果分别为(488.3±188.2)pg/ml vs.(555.8±165.8)pg/ml、(76.9±30.9)nmol/L vs.(41.0±15.6)nmol/L以及2.9±3.5 vs.5.3±2.6,,两组比较均具有显著统计学差异(P<0.001)。根据性别不同进行亚组分析SHBG值和FAI值均存在相似的统计学关联。而且男性DCM组的血清T值高于男性健康对照组,且血清ERα值略高,结果分别为(540.8±186.0)pg/ml vs.(656.3±112.9)pg/ml,P<0.001和(1.0±0.6)ng/ml vs.(0.8±0.4)ng/ml,P=0.042。除此之外,各组间的血清ERα和ERβ比较无统计学差异。
　　4.血清BPA与性激素水平的相关性:控制各项混杂因素后,采用线性回归方法分析血清BPA水平与性激素各项指标的相关性,结果显示血清BPA水平与SHBG水平呈现正相关性(β=0.041,95% CI(0.024-0.058),P<0.001)。血清BPA与其他性激素参数无相关性。
　　结论:
　　1.与健康人群相比较,DCM患者血清BPA水平、SHBG水平均增高,而FAI值和血清T水平较低,且这些统计学关联无性别差异。
　　2.血清BPA水平与SHBG水平具有正相关性,与其他性激素参数未见统计学关联,但DCM组BPA水平较高的同时,FAI值和T水平均低于健康对照组。这些结果提示DCM患者BPA高水平暴露可能引起体内SHBG水平相应升高。

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中英文缩略词表

第1章 前言

1.1 概述

1.2 扩张型心肌病的分子遗传学

1.3室性心律失常与钾离子通道突变

1.4 双酚A与心血管疾病

第2章 扩张型心肌病并室性心动过速患者的分子遗传学机制研究

2.1 研究对象与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 结论

第3章 环境内分泌干扰化合物双酚A与扩张型心肌病的相关性探讨

3.1 研究对象与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 结论

全文总结

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述一

综述二