microRNA介导Wnt通路抑制A549肺癌细胞球增殖能力的研究

摘要

目前在世界范围内,肺癌是威胁公共健康的主要原因之一。研究发现肺癌高死亡率主要是化疗仅能杀灭对化疗药物敏感的肿瘤细胞,而无法有效杀灭天然耐药或通过突变获得耐药能力的一类亚群肿瘤细胞,使得肿瘤出现复发和耐药,最终导致治疗的失败。近年来的研究证实这一类亚群肿瘤细胞不仅具有耐药的能力,还具有自我更新、再生等干细胞特性,故被称为肿瘤干/祖细胞(cancer stem/initiating cell)。目前寻找基因靶点,有效杀灭肿瘤干细胞已成为肿瘤治疗的主要关注点之一。
　　microRNAs(miRNAs)是一种内源性的、含有18-25个核苷酸的单链非编码RNA,其主要通过与特定靶mRNA的3’端UTR的互补(包括完全性和非完全性),抑制靶mRNA的翻译或促进靶mRNA的降解,从而发挥调控作用。由于其具有一个miRNA可作用于多个靶点的独特作用,因此通常miRNA影响靶点的表达以及靶点相关的信号通路使其发挥的效应进一步放大。目前研究发现miRNA在维持细胞正常机能方面发挥着重要的作用,当miRNA的表达或结构发生异常时,可导致肿瘤的发生。
　　Wnt家族蛋白是一种分泌型富含半胱氨酸的糖蛋白,包括19种高度保守的蛋白。Wnt蛋白在细胞发育以及调控细胞生理功能,如细胞增殖、分化、凋亡、黏附、迁移和极性等方面发挥着关键作用。Wnt蛋白的调节异常可导致发育、增殖和血管发生的异常,最终可引起肿瘤的发生。近年的研究证实,Wnt信号通路在肿瘤的生长、侵袭中发挥着重要作用。
　　大量证据表明miRNA表达的改变通过影响其介导的包括Wnt/β-catenin经典信号通路在内的多条与肿瘤发生、发展相关的信号通路。但对于miRNA是否能调控Wnt信号通路对肿瘤干细胞增殖的影响尚不清楚。因此,本研究旨在探讨调控肺癌干细胞的候选miRNA,并验证其通过干扰Wnt信号通路对肺癌干细胞的增殖产生影响,以期为肺癌干细胞的靶向治疗提供理论基础。
　　研究目的:
　　1.研究Wnt蛋白对富含CD133+CD44+的A549细胞球增殖的调控作用;
　　2.筛选肿瘤组织与癌旁组织中差异表达的miRNA;
　　3.探讨miRNA介导的Wnt信号通路对A549细胞球增殖的调控作用。
　　材料和方法:
　　实验材料:
　　肺腺癌组织以及癌旁组织由南昌大学第二附属医院心胸外科提供,腺癌A549细胞株由南昌大学第二附属医院呼吸科提供。
　　实验方法:
　　1.普通A549细胞、293T细胞和A549细胞球的培养;
　　2.质粒的扩增和提取;
　　3.病毒的包装、纯化与浓缩;
　　4.Wnt5a RNAi、Wnt2 RNAi以及miR-4686和miR-21抑制物的转染;
　　5.流式细胞技术检测细胞CD133、CD44的表达;
　　6.MTT法检测细胞增殖抑制率;
　　7.Western blot检测Wnt5a、Wnt2、DKK2和β-catenin蛋白的表达;
　　8.微列阵芯片检测肺癌组织的miRNA异常表达谱;
　　9.RT-PCR检测miRNA-4686、miR-21、Wnt5a、Wnt2和β-catenin基因的表达。
　　结果:
　　1.Wnt5a、Wnt2蛋白、miR-4686和miR-21在A549细胞球中的表达高于A549细胞(P<0.05);
　　2.RNA干扰Wnt5a和Wnt2蛋白表达可抑制A549细胞球增殖能力(P<0.05);
　　3.抑制A549细胞球中miR-21表达后,其DKK2蛋白表达上调,β-catenin蛋白表达下调、细胞增殖能力减低(P<0.05);
　　4.肺癌组织中miR-4686等27个miRNA表达较癌旁组织中的表达上调(P<0.05),肺癌组织中有6个miRNA的表达较癌旁组织中的表达下调(P<0.05);
　　5.抑制A549细胞球中miR-4686表达后,其Wnt5a、Wnt2和β-catenin的mRNA和蛋白表达下调、细胞增殖能力减低(P<0.05)。
　　结论:
　　1.Wnt蛋白参与调控A549细胞球的增殖;
　　2.肺腺癌组织与癌旁组织中miRNA表达存在差异;
　　3.miR-4686和miR-21抑制物可通过下调介导的Wnt信号通路抑制A549细胞球的增殖。

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中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 RNA干扰Wnt蛋白通路对A549细胞球增殖的影响

2.1 材料和方法

2.2 结 果

2.3 讨 论

第3章 miR-21抑制物对A549细胞球增殖及Wnt信号通路的影响

3.1 材料和方法

3.2 结 果

3.3 讨 论

第4章 肺癌组织差异性microRNA表达筛选

4.1 材料和方法

4.2 结 果

4.3 讨 论

第5章 miR-4686抑制物对A549细胞球增殖和wnt信号通路的影响

5.1 材料和方法

5.2 结 果

5.3 讨 论

第6章 结论及展望

6.1 结论

6.2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述