草鱼Ⅱ型细胞因子受体基因CRFB1和CRFB5的克隆、鉴定

摘要

草鱼是中国最大的经济淡水大宗鱼养殖品种。在养殖过程中，病毒感染导致的草鱼大量死亡一直困扰着从业者。干扰素(IFN)是一种多能的细胞因子，具有广泛的生物学活性。利用基因工程技术生产的重组干扰素目前被广泛用于人及经济动物病毒病的防控。其中，I型IFN在细胞抗病毒功能中起着非常重要的作用。鱼类I型IFN和哺乳动物的一样也是通过和细胞膜上相应的受体结合而发挥其潜在的抗病毒作用。鱼类I型IFN受体是一种酶偶联受体，由两个II型细胞因子受体组成。对草鱼IFN受体的研究，有助于我们进一步了解和丰富对鱼类IFN抗病毒信号通路的认识，从而为鱼类的健康养殖提供理论保证。
　　参照已报道的斑马鱼I型IFN group I的两个受体亚基CRFB1和CRFB5序列，本研究通过同源克隆技术成功克隆了草鱼相应的两个I型IFN受体亚基基因，命名为CiCRFB1和CiCRFB5。CiCRFB1和CiCRFB5的全长cDNA序列分别为2945bp和1517bp。通过序列分析发现，CiCRFB1和斑马鱼的CRFB1有74％的相似性，CiCRFB5和斑马鱼的CRFB5有70%的相似性。系统进化分析也表明，相对其他物种的I型IFN受体，CiCRFB1和CiCRFB5分别和斑马鱼的CRFB1和CRFB5有很高的相似性。CiCRFB1和CiCRFB5的胞外域都由200个氨基酸组成，包含两个由一个链接器链接的两个FnIII结构域，靠近胞外域它们都有一个单次跨膜的跨膜区，CiCRFB1(279氨基酸)有一个比CiCRFB5(129氨基酸)更长的胞内域。在草鱼出血病病毒和Poly I:C的刺激下，CiCRFB1和CiCRFB5的表达量都有不同程度的提高，表明它们可能参与了细胞抗病毒反应，即它们可能和鱼类细胞抗病毒信号通路相关。
　　为了进一步的了解CiCRFB1和CiCRFB5在抗病毒反应中的作用，我们在大肠杆菌BL21中表达了CiCRFB1、CiCRFB5胞外域和草鱼I型IFN的蛋白，并经过镍柱得到相应的纯化蛋白。通过化学交联反应探讨草鱼I型IFN与CiCRFB1和CiCRFB5胞外域，即CiCRFB1-EC和CiCRFB5-EC的亲和性，结果表明：在草鱼I型IFN的诱导下，CiCRFB5-EC更容易形成稳定的二聚体。然而，CiIFN更倾向和有更长的胞外域CiCRFB1的二聚体结合。更有趣的是，在没有化学交联剂DSS存在的情况下，CiIFN不能诱导CiCRFB1-EC和CiCRFB5-EC形成稳定的异源二聚体；而在DSS存在的情况下，CiIFN可以与CiCRFB1-EC和CiCRFB5-EC异源二聚体形成复合物。因此，CiIFN既可以和CiCRFB的同源二聚体也可以和CiCRFB的异源二聚体结合。

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第一章 前 言

1.1 哺乳类动物干扰素

1.2 哺乳类动物干扰素受体

1.3 鱼类干扰素

1.4 鱼类干扰素受体

1.5 鱼类干扰素介导的信号通路

1.6 研究目的与意义

第二章 材料和方法

2.1 材料

2.2 实验方法

第三章 结果与分析

3.1草鱼CRFB1及CRFB5 cDNA的克隆及其分析

3.2系统进化分析

3.3草鱼CRFB1和CRFB5的表达分析

3.4草鱼IFN、CRFB1-EC和CRFB5-EC的蛋白

3.5 草鱼CRFB1、CRFB5蛋白与IFN蛋白亲和力

第四章 结论与展望

致谢

参考文献

附录：攻读学位期间发表论文