慢性乙肝患者抗病毒治疗与停药复发后体内HBV特异性T细胞的研究

摘要

目的：
　　研究免疫耐受期、抗病毒治疗和停药复发的慢性乙型病毒性肝炎患者外周血中HBV特异性CD8+T细胞的水平及免疫功能，探讨停药复发患者短时间内出现严重肝损害的可能原因。
　　方法：
　　1.研究对象
　　收集2014年5月至2014年12月就诊于南昌大学第一附属医院传染科的CHB患者111例，经HLA-A2组织分型得到HLA-A2+49例，分成三组：免疫耐受组15例，男11例，女4例，平均28.8±8.3岁，均为免疫耐受期患者（即ALT正常、HBeAg阳性、HBV-DNA持续高水平、肝组织没有或仅有轻微炎症）；抗病毒治疗组20例，男14例，女6例，平均41.0±14.3岁，为经过抗病毒治疗后HBV-DNA持续阴性6个月以上；停药复发组14例，男10例，女4例，平均44.9±11.2岁，为经过核苷（酸）类似物抗病毒治疗HBV-DNA转阴至少6个月以上而停药复发者。所有患者均符合2010年版《慢性乙型肝炎防治指南》中确定的诊断标准；均排外合并药物、毒物、酒精、其他病毒、遗传代谢性疾病等所致肝损者。收集健康者25例，经分型得到HLA-A2+者8例，男5例，女3例，平均年龄35.9±9.2岁，作为阴性对照组；排除HAV、HBV、HCV、HDV、HEV及HIV等感染。
　　2.实验方法
　　收集受试者HBV-DNA、HBeAg、丙氨酸氨基转移酶（ALT）等临床指标。HBV-DNA的检测采用实时荧光定量PCR法，血清HBeAg采用雅培Axsym全自动化学发光免疫分析仪检测，ALT采用日立7600型全自动生化分析检测；采用流式细胞术进行HLA-A2分型；采用MHC-五聚体流式细胞术检测HLA-A2阳性患者HBcAg18-27特异性CD8+T细胞的数量；分离外周血单个核细胞（PBMC），采用ELISPOT检测HBV特异性CTL分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子功能。分析各组特异性 T细胞数量及分泌功能之间的差异，及它们与HBV-DNA、HBeAg之间的相关性。
　　结果：
　　（1）免疫耐受组患者HBV特异性CD8+T细胞数量及免疫功能明显低于抗病毒治疗组，差异有统计学意义（P<0.01）。
　　（2）在免疫耐受组患者，HBV特异性CD8+T细胞的数量与血清HBV-DNA滴度、HBeAg之间呈明显的负相关（r=－0.882，P<0.001；r=－0.755，P=0.001），细胞因子分泌功能与HBV-DNA滴度、HBeAg之间也呈明显负相关性（分泌IFN-γ：r=－0.837，P<0.001；r=－0.787，P<0.001；分泌TNF-α：r=－0.685，P=0.005；r=－0.671，P=0.006）。
　　（3）在抗病毒治疗组患者，HBV特异性CD8+T细胞的数量增多，且随HBV-DNA阴转时间延长、HBeAg水平的下降而增强，恢复峰值出现在HBV-DNA转阴1年左右，之后随阴转时间延长而表现出降低趋势，并维持在较低水平。
　　（4）停药复发组患者HBV特异性CD8+T细胞数量及免疫功能均高于抗病毒治疗组（P<0.05）和免疫耐受组（P<0.01），差异有统计学意义。
　　（5）三组患者HBV特异性CD8+T细胞的数量及免疫功能均高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。
　　结论：
　　CHB患者HBV特异性CD8+T细胞的数量减少及免疫功能受损，可能与T细胞长期暴露在大量HBV抗原环境中导致T细胞耗竭有关；抗病毒治疗能使HBV特异性T细胞的水平及功能得到恢复，但一味的抗病毒治疗可能不利于机体特异性抗病毒免疫的维持；停药复发患者短时间内出现肝损害，并且肝损害往往较重，可能与HBV特异性T细胞功能恢复和记忆性T淋巴细胞受反弹的HBV的刺激短时间内产生大量效应性T淋巴细胞导致肝细胞大量损伤坏死有关。

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中英文缩略词表

第1章 前言

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 研究对象与分组

2.1.2 基本材料

2.1.3主要仪器

2.1.4 主要试剂

2.1.5 常用试剂配制

2.2研究方法

2.2.1 血清HBV-DNA定量、HBeAg定量及血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)的检测

2.2.2 标本的采集与处理

2.2.3 HLA-A2等位型鉴定

2.2.4 Pentamers流式细胞术检测外周HBV特异性CD8+T细胞的数量

2.2.5 ELISPOT技术检测特异性CD8+T细胞（CTL）表达INF-γ和TNF-α的水平

2.3 统计方法

第3章 结果

3.1 研究对象的基本情况及HLA-A2分型结果

3.2 HBV特异性CD8+T淋巴细胞数量检测结果

3.3 ELISPOT技术检测特异性CD8+T细胞表达INF-γ和TNF-α的水平

3.4 HBV特异性CD8+T细胞数量与HBV-DNA阴转时间及HBeAg水平之间的关系

3.5 HBV特异性CD8+T细胞数量、分泌功能与HBV-DNA水平及HBeAg水平之间的相关性

第4章 讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: 乙型肝炎病毒感染的免疫学研究进展