iPSCs-MSCs来源的外泌体修复缺血性组织损伤的作用及其机制研究

摘要

背景与目的：
　　缺血性组织损伤是临床缺血性疾病中常见的病理过程，缺血性心脏病、缺血性脑血管病及缺血性外周血管病等都可因缺血缺氧而造成组织器官的功能受损，尽快恢复缺血组织的血液供给有助于各种缺血性损伤的修复。近年来，利用干细胞移植修复缺血性组织损伤的相关研究十分活跃，由诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）分化而来的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）展现出较成体MSCs更强大的减轻缺血性组织损伤，促进缺血组织血管新生及功能恢复的功能，因而在干细胞治疗领域展现了良好的应用前景。但是，干细胞移植应用于临床治疗始终存在一定风险，如遗传物质变异、移植细胞栓塞血管和致瘤致畸等。最新研究发现干细胞主要通过旁分泌机制发挥其治疗功能，而外泌体是其中一种重要的旁分泌因子。外泌体是细胞分泌的一种直径约40～100nm的囊泡，其内包裹有来源细胞内的多种蛋白质、miRNAs等物质，在缺血性损伤组织内直接移植干细胞来源外泌体可以发挥类似移植干细胞样的修复组织损伤的作用。因此，由诱导多能干细胞分化形成的间充质干细胞（iPSCs-MSCs,iMSCs）来源的外泌体（iMSCs-exosome,iMSC-Exo）是否具有强大的修复缺血性损伤的功能值得深入研究。本实验通过建立下肢缺血模型及脑缺血模型模拟人体常见的外周及中枢系统缺血性疾病，在此基础上观察iMSC-Exo对缺血下肢及缺血脑组织的修复作用，并分析是否通过促进缺血组织的血管新生发挥此修复功能，随后体外实验进一步分析其促血管新生的功能及可能的机制。通过此项研究，以期为缺血性疾病的治疗提供一条新模式。
　　内容和方法：
　　1.iPSCs向MSCs定向分化及iMSC-Exo的富集
　　1.1 iPSCs向MSCs定向分化：采用一步法将iPSCs定向分化为MSCs；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测各细胞多能干性基因及中胚层基因表达水平；流式细胞术鉴定iMSCs表面标志物的表达；采用经典的成骨、成脂、成软骨诱导法检测iMSCs的多向分化潜能。
　　1.2 iMSC-Exo的富集与鉴定：无血清培养基培养iMSCs48h，超速离心法收集iMSC-Exo；透射电镜观察iMSC-Exo的形态；高分辨率可调电阻脉冲技术确定iMSC-Exo的直径；Western blot鉴定iMSC-Exo的特异标志物。
　　2.体内实验观察iMSC-Exo对缺血组织的修复作用及对血管新生的影响
　　2.1 iMSC-Exo对缺血下肢的修复作用及对血管新生的影响
　　2.1.1 建立小鼠下肢缺血模型（Hind-limb ischemia，HLI），股四头肌内多点注射法移植iMSC-Exo。
　　2.1.2 缺血下肢梗死程度的比较及缺血肌肉细胞形态变化：统计术后21天各组小鼠缺血下肢梗死程度：完整，坏疽，截肢；H&E染色比较术后21天各组缺血股四头肌细胞形态变化。
　　2.1.3 激光多普勒检测术后1、7、14、21天缺血下肢血流恢复程度。
　　2.1.4 缺血股四头肌冰冻切片CD31及CD34染色比较各组术后14天和21天缺血肌肉内微血管密度变化。
　　2.2 iMSC-Exo对缺血脑组织的修复作用及对血管新生的影响
　　2.2.1 建立大鼠大脑中动脉栓塞模型（Middle cerebral artery occlusion,MCAO），尾静脉移植iMSC-Exo。
　　2.2.2 利用mNSS评分系统观察术前，术后1、3、7、14、21、28天大鼠神经功能改善状况；TTC染色比较术后1天及术后28天各组脑组织梗死程度。
　　2.2.3 移植后分别30min、1h、6h检测iMSC-Exo缺血脑组织内定位及细胞内定位。
　　2.2.4 冰冻切片CD31及CD34染色比较各组术后14天和28天缺血脑组织内微血管密度变化。
　　3.体外研究分析iMSC-Exo促血管新生的机制
　　3.1 原代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）的分离培养与鉴定。
　　3.2 免疫荧光双染法观察HUVECs内吞iMSC-Exo的效率。
　　3.3 iMSC-Exo促进HUVECs迁移、增殖和成管：RTCA法及划痕实验检测HUVECs的迁移能力；CCK8法检测HUVECs的增殖能力；体外基质胶法检测HUVECs的成管能力。
　　3.4 iMSC-Exo促进HUVECs表达血管新生相关分子：qRT-PCR及ELISA分别检测不同浓度iMSC-Exo刺激HUVECs24h及48h，其表达的血管新生相关基因及分泌的血管新生相关蛋白的水平。
　　3.5 miRNAs芯片检测iMSC-Exo内的miRNAs，分析其中高丰度表达的与血管新生有关的miRNAs。
　　结果：
　　1.成功诱导形成iMSCs及富集iMSC-Exo
　　1.1 成功建立体外iPSCs向MSCs定向分化的方法，iMSCs呈典型的长梭形；流式细胞术结果显示细胞表型CD29、CD44、CD73、CD90、CD105及CD146表达阳性，CD34、CD45、CD133及HLA-DR表达阴性，符合典型的间充质干细胞的特征；qRT-PCR显示iMSCs不表达多能干性基因Nanog及Oct4。多向分化结果显示iMSCs具有成骨分化、成脂分化及成软骨分化的能力。
　　1.2 采用超速离心法成功富集iMSC-Exo；透射电镜显示iMSC-Exo呈圆形或半圆形，直径40nm～100nm；高分辨率可调电阻脉冲技术显示iMSC-Exo直径中位数为84nm，平均直径122nm；Western blot检测结果表明iMSC-Exo表达CD9、CD63和CD81分子，符合间充质干细胞外泌体的特征。
　　2. iMSC-Exo修复缺血组织并促进缺血组织内的血管新生
　　2.1 iMSC-Exo修复缺血下肢并促进血管新生：统计术后21天各组缺血下肢梗死程度，结果显示假手术组小鼠下肢全部存活，无截肢及坏疽；Control组小鼠下肢坏疽及截肢明显，70％出现截肢，20%出现严重的坏疽，只有10%下肢完整；iMSC-Exo组小鼠有10%出现了截肢，25%出现了坏疽，65%肢体完整。H&E染色结果显示术后21天，假手术组肌肉细胞完整，饱满，无明显凋亡；iMSC-Exo组肌肉细胞萎缩，出现凋亡，而Control组肌肉细胞萎缩及凋亡程度均较iMSC-Exo组明显加重。激光多普勒结果显示术后iMSC-Exo组缺血下肢血流逐渐恢复，第14天和第21天下肢血流较术后0天明显改善。而术后Control组下肢血流无明显改善，14天后可见有截肢现象。免疫荧光CD31及CD34染色结果显示14天和21天CD31阳性细胞数分别是Control组的3.14、3.46倍，CD34阳性细胞数分别是Control组的2.64、3.01倍。
　　2.2 iMSC-Exo修复缺血脑组织并促进血管新生：尾静脉移植iMSC-Exo，iMSC-Exo组与Control组神经功能在术后1、3、7天无明显差异，而术后14、21、28天，iMSC-Exo组大鼠神经功能恢复状况要明显好于Control组。TTC染色结果显示：iMSC-Exo能减少脑梗死组织的梗死体积。尾静脉移植绿色荧光标记iMSC-Exo，30min后即可见缺血脑组织内有iMSC-Exo分布，6h可见大量iMSC-Exo分布于缺血脑组织内，移植后6h在血管内皮细胞、神经元、神经干细胞内均可见iMSC-Exo分布。免疫荧光CD31及CD34染色结果显示14天和28天CD31阳性细胞数分别是Control组的3.01、1.99倍，CD34阳性细胞数分别是Control组的2.46、2.05倍。
　　3.iMSC-Exo具有体外促血管新生能力
　　iMSC-Exo与HUVECs的共培养结果显示HUVECs能够内吞iMSC-Exo，内吞量随时间增加而增大。RTCA及划痕实验结果均显示iMSC-Exo可明显促进HUVECs的迁移。CCK8结果显示iMSC-Exo能够明显促进HUVECs的增殖。体外基质胶成管实验结果显示iMSC-Exo能够促进HUVECs成管。qRT-PCR显示iMSC-Exo能促进 HUVECs内血管新生相关基因的表达，ELISA显示iMSC-Exo能促进 HUVECs分泌血管新生相关蛋白。miRNAs芯片结果显示iMSC-Exo内含有32种血管新生相关的miRNAs，并且高丰度表达miR210、miR126、miR103、miR424、miR378、let-7α、let-7e这7种促血管新生miRNAs。
　　结论：
　　1.缺血下肢内局部移植iMSC-Exo能够减轻缺血下肢的损伤，促进缺血下肢的功能恢复；尾静脉移植iMSC-Exo能够减轻缺血脑组织的损伤并促进缺血脑组织的功能恢复。
　　2.局部移植iMSC-Exo能够促进缺血下肢肌肉内的血管新生；尾静脉移植iMSC-Exo能够促进缺血脑组织内的血管新生。
　　3.iMSC-Exo干预能够促进体外培养的HUVECs的迁移、增殖及成管，并能够促进HUVECs内血管新生相关基因的表达及蛋白的分泌。
　　4.iMSC-Exo内高丰度表达多种血管新生相关性miRNAs，这些miRNAs可能参与iMSC-Exo的促血管新生功能。
　　本研究结果表明，iMSC-Exo主要通过促进血管新生，提高缺血组织内的血流灌注，从而减轻缺血性组织损伤，并促进损伤组织的功能恢复。提示iMSC-Exo移植有望成为一种替代干细胞治疗缺血性组织损伤的新策略。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 iPSCs向MSCs定向分化及iMSC-Exo的富集

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 统计学分析

第3章 体内实验观察iMSC-Exo对缺血组织的修复作用及对血管新生的影响

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 统计学分析

第4章 体外研究分析iMSC-Exo促血管新生的机制

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 统计学分析

第5章 实验结果

5.1 iPSCs向MSCs定向分化及成功富集iMSC-Exo

5.2 iMSC-Exo修复缺血组织并促进缺血组织内的血管新生

5.3 体外研究分析iMSC-Exo促血管新生的机制

第6章 讨论

6.1 iMSCs是具有良好应用前景的种子细胞

6.2 外泌体的生物学特性

6.3 iMSC-Exo促进缺血组织内的血管新生

6.4 iMSC-Exo促进血管新生的机制

第7章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述: 外泌体及其在干细胞中的研究进展